神經(jīng)生長因子和增殖細胞核抗原在人腦膠質(zhì)瘤中意義探究的論文
膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展與細胞增殖、分化、遷移、凋亡及血管生成的信號通路異常有關(guān)。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)主要來源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可以誘導神經(jīng)纖維生長，并影響瘤細胞的增生、分化及凋亡。增殖細胞核抗原(proliferation cell nuclearantigen，PCNA)是一種反映細胞增殖的可靠指標。本實驗采用免疫組化技術(shù)，對膠質(zhì)瘤中NGF及PCNA的表達進行研究，探討它們與膠質(zhì)瘤病理分級的關(guān)系及其在評估膠質(zhì)瘤患者預后中的作用。
1 材料與方法
1.1 資料 武漢大學人民醫(yī)院神經(jīng)外科2010年7月至2012年4月收治的64例腦膠質(zhì)瘤患者，男性36例，女性28例;年齡21-60歲，平均42歲。所有患者手術(shù)前均未接受放療或化療，術(shù)中留取的腫瘤組織標本送病理科，經(jīng)兩名病理科醫(yī)師檢查確診。根據(jù)2000年WHO病理學分級標準，Ⅰ級14例，Ⅱ級16例，Ⅲ級18例，Ⅳ級16例。定義Ⅰ-Ⅱ級為低級別膠質(zhì)瘤組，共計30例;Ⅲ-Ⅳ級為高級別膠質(zhì)瘤組，共計34例。64例患者中，隨訪生存時間>2年者29例，≤2年者35例。作為對照的10例正常腦組織標本來自因顱腦損傷行開顱內(nèi)減壓術(shù)的患者，其固定、包埋、切片程序同膠質(zhì)瘤標本。
1.2 試劑 兔抗人NGF多克隆抗體(稀釋度1∶150)，PCNA單克隆抗體(稀釋度1∶150)及Ultra-Sensitive SP試劑盒、多聚-L-賴氨酸溶液、DAB顯色試劑盒等購于武漢博士德生物制品公司。磷酸鹽緩沖液(phosphonate buffer solution，PBS)購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司�？乖捎梦⒉t加熱進行修復。
1.3 免疫組化染色方法 所有腫瘤及正常腦組織標本均經(jīng)甲醛固定，并石蠟包埋切片(4μm)，免疫組化染色嚴格按照試劑盒操作說明進行，采用微波修復抗原。陰性對照標本僅以PBS液替代一抗，余操作相同。
1.4 結(jié)果判定 為避免觀察測量偏倚，對參與閱片的病理科醫(yī)師采取盲法原則，且由兩名病理科醫(yī)師分別進行閱片并確診。NGF陽性染色表現(xiàn)為細胞核及細胞質(zhì)被染成棕黃色;PCNA 陽性染色則主要表現(xiàn)為胞核被染成黃色或棕黃色。隨機選擇5-10個高倍視野進行細胞計數(shù)，陽性表達率按陽性染色的細胞數(shù)占細胞總數(shù)的百分比判斷。將陽性表達率10%-25%定義為(+);25%-50%定義為(-);>50%定義為(+);將標本陽性細胞百分率<10%定義為(-)。
1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學處理，采用χ2檢驗進行兩組間陽性表達率的比較;采用Spearman等級相關(guān)分析計算兩因數(shù)之間的相關(guān)性，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
2 結(jié)果
2.1 NGF及PCNA在正常腦組織及膠質(zhì)瘤內(nèi)的表達 膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)NGF和PCNA的陽性表達率明顯高于正常腦組織(P<0.05)，兩者在高級別膠質(zhì)瘤組與低級別膠質(zhì)瘤組間的陽性細胞表達率也有顯著差異(P<0.05)，在生存時間≤2年組中，ngf及pcna陽性表達率均高于生存時間>2年組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
2.2 NGF 與PCNA 的相關(guān)性分析 本研究經(jīng)Spearman等級相關(guān)檢驗分析顯示，NGF與PCNA在人腦膠質(zhì)瘤中的表達呈正相關(guān)(P<0.05，rs=1.000)。
3 討論
NGF及其受體廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并存在于大多數(shù)神經(jīng)元及膠質(zhì)細胞中，維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能，同時對神經(jīng)細胞的生長與分化具有重要的調(diào)節(jié)作用。目前，NGF與腫瘤生長的關(guān)系日益受到關(guān)注，研究已證實NGF參與了非中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的過程。關(guān)于NGF對人腦膠質(zhì)瘤的作用，亦有相關(guān)研究。張志堅等在體外人腦膠質(zhì)瘤細胞株U251細胞的實驗研究中發(fā)現(xiàn)，U251細胞能夠高表達NGF并將其分泌至細胞外，同時，U251細胞對其高親和力受體-酪氨酸蛋白激酶受體A(TrkA)亦有高表達。細胞在分裂相貼壁生長6h后，后者主要定位于細胞膜，此時細胞外NGF與細胞膜上TrkA 結(jié)合后形成復合物內(nèi)化入并進入細胞內(nèi);在細胞培養(yǎng)12h以及G1/S期時，兩者共同位于細胞核內(nèi)，通過多靶點作用模式對U251細胞的生物學行為進行調(diào)控。另外，NGF還能夠通過TrkA介導的信號轉(zhuǎn)導機制，抑制機體產(chǎn)生與分泌腫瘤相關(guān)的免疫球蛋白，從而有助于腫瘤細胞的免疫逃避。而更早的研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤細胞株U251、U87和U373細胞可在外源性NGF的作用下增殖，其增殖效應呈現(xiàn)NGF的劑量依賴性。
本研究發(fā)現(xiàn)顯微鏡下可見NGF主要表達于膠質(zhì)瘤細胞的胞質(zhì)和胞核，并且在膠質(zhì)瘤中的表達明顯高于其在正常腦組織中的表達(P<0.05)，并隨著膠質(zhì)瘤惡性級別的增高而表達增強。另外，ngf在生存時間≤2年組中的陽性表達率顯著高于其在生存時間>2年組的表達。以上研究說明，NGF與膠質(zhì)瘤的病理分級密切相關(guān)，并能對膠質(zhì)瘤患者的預后進行評估。
膠質(zhì)瘤細胞的增殖活性很強，而PCNA 為人類基因組中高度保守的基因，僅在增殖細胞中合成，很少存在于靜止期的細胞中，研究表明，檢測PCNA與腫瘤的增殖特性密切相關(guān)，對判斷腫瘤的分化程度和腫瘤患者的預后有重要的參考價值，并能作為腦膠質(zhì)瘤復發(fā)的預測指標。
本研究顯示，正常腦組織中未見PCNA的表達，而在膠質(zhì)瘤細胞中PCNA 呈陽性表達，且高級別膠質(zhì)瘤組中PCNA 的陽性表達率明顯高于其在低級別膠質(zhì)瘤組中的表達(P<0.05)，提示PCNA表達與腦膠質(zhì)瘤的惡性行為相關(guān)。同時對不同生存時間患者的腫瘤細胞中PCNA 的.表達率進行比較發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)瘤細胞中PCNA的表達水平與患者術(shù)后生存時間呈負相關(guān)，因此我們認為，膠質(zhì)瘤中PCNA的表達水平可作為評估患者預后的指標。
在一項體外培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細胞的實驗研究中，受NGF作用的HUEVC304細胞中，PCNA 的表達增加明顯高于對照組(P<0.01)，提示NGF可能對PCNA 的表達有促進作用。本研究發(fā)現(xiàn)人腦膠質(zhì)瘤組織中的NGF和PCNA蛋白表達呈正相關(guān)，進一步提示了NGF可促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖，亦提示NGF及PCNA可能在膠質(zhì)瘤的侵襲及惡性進展過程中起著協(xié)同作用，二者在人腦膠質(zhì)瘤組織中的高度表達，預示著膠質(zhì)瘤的惡性程度高，患者的預后差。繼續(xù)深入研究二者在膠質(zhì)瘤侵襲性中的相關(guān)關(guān)系，并進一步探討其詳細的生物學機制，為從分子水平上進行膠質(zhì)瘤的治療提供了新的方向。
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