生育二孩高齡產(chǎn)婦的遺傳研究論文
隨著國(guó)家“全面二孩”政策的落實(shí)，要求生育的高齡婦女?dāng)?shù)量不斷增加，高齡女性生育問(wèn)題已成為生殖醫(yī)學(xué)的關(guān)注熱點(diǎn)。在對(duì)高齡女性開(kāi)展生育咨詢(xún)時(shí)，不僅應(yīng)強(qiáng)調(diào)3個(gè)增高的風(fēng)險(xiǎn)(不孕率增加、流產(chǎn)率增加、畸形兒增加)，同時(shí)還應(yīng)該告知加強(qiáng)三查，即孕前檢查，植入前遺傳學(xué)檢查及產(chǎn)前檢查。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的技術(shù)可以幫助解決高齡婦女的生育問(wèn)題。應(yīng)用多種遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)(包括細(xì)胞遺傳學(xué)、亞細(xì)胞遺傳學(xué)、生化遺傳學(xué)、免疫遺傳學(xué)、分子遺傳學(xué)等)，結(jié)合醫(yī)學(xué)影像學(xué)和計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)分析，對(duì)準(zhǔn)備妊娠夫婦在遺傳咨詢(xún)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行孕前檢查;對(duì)欲行IVF/ICSI的夫婦進(jìn)行PGD/PGS及產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷;應(yīng)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)方法直接檢測(cè)胚胎和胎兒，或通過(guò)對(duì)母體的檢查預(yù)測(cè)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育狀況，診斷胎兒是否有缺陷及先天畸形，并提出醫(yī)學(xué)建議，均可有效降低出生缺陷的風(fēng)險(xiǎn)。本文針對(duì)高齡產(chǎn)婦所面臨的問(wèn)題，就如何開(kāi)展遺傳咨詢(xún)進(jìn)行討論。
1高齡婦女生育面臨的問(wèn)題
1.1高齡婦女不孕率增加
高齡產(chǎn)婦(≥35歲)引起不孕率增加主要原因?yàn)椋郝炎永匣�、卵母�?xì)胞質(zhì)量改變;卵巢儲(chǔ)備功能減退;胚胎種植率下降;染色體分離錯(cuò)誤，染色體異常幾率增加等。在輔助生育技術(shù)中，應(yīng)用IVF/ICSI技術(shù)，婦女的年齡是IVF成功與否的重要因素。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，年齡<34歲成功率高可達(dá)50%，年齡≥35歲成功率在30%左右，年齡>40歲成功率10%左右。應(yīng)用人工授精技術(shù)，妊娠率隨年齡的增加而下降，國(guó)內(nèi)外資料各項(xiàng)研究均表明，<30歲的婦女前3個(gè)周期的周期妊娠率平均為10%，而≥35歲婦女前3個(gè)周期的周期妊娠率則為6%，>40歲的婦女臨床妊娠率明顯下降�？梢�(jiàn)年齡與妊娠率呈負(fù)相關(guān)。
1.2高齡婦女流產(chǎn)率增加
據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，流產(chǎn)占生育夫婦的15%，高齡孕婦流產(chǎn)率為30%～40%。在高齡孕婦流產(chǎn)比例中，僅染色體異常一項(xiàng)就占50%～80%。高齡會(huì)導(dǎo)致致死性染色體異常增加，這些染色體異常胚胎必發(fā)生流產(chǎn)。第一種異常為多倍體(三倍體、四倍體)，一般在孕早期就發(fā)生流產(chǎn);第二種異常為單體型，除X單體(45，X綜合征)部分可以出生外，其它單體一般都導(dǎo)致流產(chǎn)，如21單體就很難出生;第三種異常為三體型，除少數(shù)三體(21三體、18三體等)出生為畸形兒外，多數(shù)三體如16三體導(dǎo)致流產(chǎn);此外還有多體型、嚴(yán)重的染色體結(jié)構(gòu)異常、嚴(yán)重的染色體微缺失、微重復(fù)以及其它染色體嚴(yán)重畸形，均可導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。
1.3高齡婦女畸形兒增加
高齡婦女生育的另一問(wèn)題是畸形兒出生率增加。年齡越大，卵細(xì)胞越容易發(fā)生變化，人體包括卵巢所承受的各種有害物質(zhì)的影響也就越多，這些因素都會(huì)使染色體發(fā)生突變的機(jī)會(huì)增多，以及染色體在細(xì)胞分裂過(guò)程中發(fā)生不分離現(xiàn)象等。表現(xiàn)為染色體病患兒出生，如21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征、Turner綜合征、Klinefelter綜合征、5p綜合征(貓叫綜合征)，以及致病的染色體微缺失微重復(fù)患兒及其他先天畸形。
2高齡婦女生育對(duì)策
2.1高齡婦女加強(qiáng)孕前檢查
遺傳咨詢(xún)的目的是通過(guò)詢(xún)問(wèn)孕產(chǎn)史，對(duì)不良孕產(chǎn)史夫婦及患兒進(jìn)行遺傳學(xué)檢查，綜合年齡及整體情況選擇助孕方式。在遺傳咨詢(xún)過(guò)程中，主要涉及以下問(wèn)題：①反復(fù)流產(chǎn)、已生育一個(gè)遺傳病患兒，需要對(duì)再次妊娠的再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估;②親代懷疑為遺傳病，要求確診。對(duì)于遺傳病再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的估計(jì)：染色體病和多基因遺傳病以其群體發(fā)病率為經(jīng)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)，而單基因遺傳病則根據(jù)遺傳方式進(jìn)行家系分析，進(jìn)行發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)估計(jì)并預(yù)測(cè)其子代患病風(fēng)險(xiǎn)。遺傳咨詢(xún)應(yīng)提供產(chǎn)前診斷方法的有關(guān)信息：根據(jù)子代可能的再現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)度，建議采取適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)前診斷方法，充分考慮診斷方法對(duì)孕婦和胎兒的風(fēng)險(xiǎn)等。目前應(yīng)用于臨床采集標(biāo)本的方法有絨毛膜穿刺、羊膜腔穿刺、臍靜脈穿刺等，產(chǎn)前診斷方法有超聲診斷、生化免疫、細(xì)胞遺傳診斷、分子遺傳診斷等，根據(jù)產(chǎn)前診斷結(jié)果提供相應(yīng)的生育建議。
2.2高齡婦女加強(qiáng)植入前遺傳學(xué)檢查
隨著女性年齡的增加，胚胎染色體非整倍體的概率增加，導(dǎo)致流產(chǎn)率及生育異常兒概率增加。應(yīng)用分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，對(duì)高齡女性進(jìn)行胚胎植入前遺傳學(xué)篩查(PGS)或診斷(PGD)，選擇健康的胚胎移植，達(dá)到生育正常后代的目的。PGD 與PGS應(yīng)用技術(shù)相同，主要區(qū)別是目標(biāo)人群不同。PGD是對(duì)已知有遺傳致病因素的人群，通過(guò)遺傳學(xué)篩查達(dá)到阻斷相關(guān)遺傳病的傳遞，如各種染色體病和某些單基因遺傳病(如血友病、地中海貧血等)。PGS針對(duì)的目標(biāo)人群較廣，通常親代本身并無(wú)基因或染色體異常，但高齡、不孕不育、反復(fù)出現(xiàn)染色體異常的胚胎或不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和反復(fù)種植失敗等。目前PGS篩查內(nèi)容不針對(duì)于特定致病遺傳因素，通常以篩查染色體非整倍體為主，其目的是提高輔助生殖的成功率，未來(lái)對(duì)高危人群進(jìn)行單基因病和遺傳基因攜帶者的篩查是PGS的發(fā)展方向。
3高齡婦女加強(qiáng)產(chǎn)前檢查
3.1產(chǎn)前篩查
孕婦高齡是產(chǎn)前診斷的直接指征，但高齡夫婦往往對(duì)來(lái)之不易的妊娠行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷顧慮重重，因此可推薦他們選擇胎兒無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前DNA(NIPT)檢測(cè)。無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)是對(duì)孕婦外周血中的胎兒游離DNA的片段進(jìn)行高通量測(cè)序，從而檢測(cè)胎兒染色體非整倍體基因。此項(xiàng)技術(shù)對(duì)21三體和18三體的檢出率及準(zhǔn)確率明顯高于孕婦血清學(xué)檢查，高齡人群是NIPT最顯著的受益者。
3.2細(xì)胞學(xué)染色體檢查
隨著女性年齡的增加，胚胎染色體非整倍體的概率增加，產(chǎn)前細(xì)胞學(xué)染色體檢查是盡早發(fā)現(xiàn)異�；純旱�.有效措施之一，其分析方便簡(jiǎn)捷、結(jié)果直觀可靠，是目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用最為廣泛的產(chǎn)前診斷方法。傳統(tǒng)羊水穿刺通常在妊娠16～23周進(jìn)行，許多中心研究已經(jīng)證實(shí)了羊水穿刺的安全性高、細(xì)胞遺傳學(xué)診斷精確性高等特點(diǎn)，而且開(kāi)展細(xì)胞學(xué)染色體分析技術(shù)所需的儀器、試劑、耗材等成本相對(duì)較低。細(xì)胞遺傳學(xué)診斷也存在一些不足和局限性。首先，標(biāo)本獲得需要在特定時(shí)間，一般在孕18～22周(這個(gè)階段羊水比較充足、細(xì)胞活性較好)，同時(shí)需要較大的標(biāo)本量且檢測(cè)周期長(zhǎng)，需要雙平行法進(jìn)行培養(yǎng)及分析，通常2～3周才能完成分析;其次檢測(cè)范圍受限，一般只能檢測(cè)>5～10MB的結(jié)構(gòu)異常，對(duì)于<5MB的結(jié)構(gòu)異常和一些額外標(biāo)記染色體的來(lái)源則無(wú)法明確診斷。此外，染色體核型分析的診斷水平與染色體制備的質(zhì)量有很大關(guān)系。相對(duì)于外周血來(lái)講，羊水細(xì)胞所制備的帶型分辨率更低，使得微小結(jié)構(gòu)異常的發(fā)現(xiàn)更加困難。有產(chǎn)前診斷研究資料顯示，被認(rèn)為是“正�！钡暮诵椭杏�10%～16%的染色體結(jié)構(gòu)還存在微小缺失和重復(fù)。最后要說(shuō)明的是，羊水細(xì)胞培養(yǎng)有一定的失敗率。
3.3FISH技術(shù)檢測(cè)
熒光原位雜交技術(shù)是將染色體顯帶技術(shù)與原位雜交技術(shù)相結(jié)合，利用DNA 分子鏈中堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，用生物素標(biāo)記探針DNA與目標(biāo)DNA在一定條件下進(jìn)行雜交后，在熒光顯微鏡下對(duì)待測(cè)DNA進(jìn)行定性、定位分析。可用于中期或間期細(xì)胞的分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究。產(chǎn)前診斷中染色體異常通常發(fā)生在21、18、13、X、Y 5條染色體上，F(xiàn)ISH 技術(shù)通過(guò)探針標(biāo)記常見(jiàn)的這5條染色體，用于產(chǎn)前診斷單純高齡因素和唐氏綜合征篩查高危孕婦，實(shí)現(xiàn)快速產(chǎn)前診斷。FISH技術(shù)應(yīng)用產(chǎn)前診斷的主要問(wèn)題為診斷范圍受限，目前可以明確診斷的染色體種類(lèi)有限，主要包括13、18、21、X、Y 5種，其它染色體數(shù)目異常及結(jié)構(gòu)異常尚無(wú)法診斷。而且，由于標(biāo)記探針位置的限定，上述5種染色體中部分三體的診斷也是FISH 診斷的盲區(qū)。如FISH技術(shù)標(biāo)記的18號(hào)染色體是著絲粒部位，因此不能診斷18號(hào)染色體長(zhǎng)臂的部分三體。而且，F(xiàn)ISH 檢測(cè)價(jià)格昂貴，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，F(xiàn)ISH 在產(chǎn)前診斷的應(yīng)用將逐漸被取代。
3.4其他亞細(xì)胞及分子學(xué)檢測(cè)
3.4.1 微陣列比較基因組雜交(aCGH) array-CGH與CGH的原理相似，使用基因組DNA 克隆點(diǎn)制到芯片上(而非細(xì)胞中期染色體)制備成array-CGH芯片，array-CGH 結(jié)合了CGH 的高通量和FISH 的高分辨率等優(yōu)點(diǎn)，一次檢測(cè)相當(dāng)于對(duì)基因組同時(shí)進(jìn)行了成千上萬(wàn)個(gè)獨(dú)立的FISH。array-CGH 檢測(cè)需要的樣本量少，無(wú)需細(xì)胞培養(yǎng)，直接提取樣品DNA即可用于實(shí)驗(yàn)，大大縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
3.4.2單核苷酸多態(tài)性微陣列(aSNP) 單核苷酸多態(tài)性(SNP)由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換、顛換以及單個(gè)堿基的缺失和插入。SNP是人類(lèi)基因組變化最主要的形式，某些SNP直接影響蛋白的結(jié)構(gòu)、表達(dá)及遺傳穩(wěn)定性等。SNP-array芯片是將大量的SNP位點(diǎn)序列采用特殊方法固定在硅芯片上，獲得高密度的SNP微陣列，然后與樣品雜交，通過(guò)激光掃描、軟件分析獲得結(jié)果。aCGH 與aSNP共同點(diǎn)：均為高通量檢測(cè)基因組中拷貝數(shù)的改變，都可以檢測(cè)染色體數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常及染色體的微缺失及重復(fù)等。缺點(diǎn)是不能診斷染色體平衡易位、倒位等，此外由于敏感性高容易造成過(guò)度診斷。
3.4.3 基因測(cè)序技術(shù) Illumina/Solexa GenomeAnalyzer測(cè)序(第二代測(cè)序)技術(shù)為一種通量更高、速度更快的測(cè)序技術(shù)，在生物學(xué)研究中廣泛應(yīng)用�；驹硎沁吅铣蛇厹y(cè)序，在Sanger等測(cè)序方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)技術(shù)創(chuàng)新用不同顏色的熒光標(biāo)記4種不同的dNTP，當(dāng)DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈時(shí)，每添加一種dNTP就會(huì)釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號(hào)并經(jīng)過(guò)特定的計(jì)算機(jī)軟件處理獲得待測(cè)DNA的序列信息�；驕y(cè)序技術(shù)提高了檢測(cè)的分辨率，同時(shí)發(fā)現(xiàn)大量的小片段的CNVs改變(<1MB)，這些CNVs與疾病的關(guān)系目前還難以解釋。某些CNVs屬于良性改變，不具有病理學(xué)意義。因此分子診斷實(shí)驗(yàn)室建立自己的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)及評(píng)估方法十分重要，包括是否為新發(fā)生的CNVs、是否曾在正常人群中被報(bào)道過(guò)、CNVs長(zhǎng)度大小、是否在文獻(xiàn)庫(kù)中有報(bào)道、是否遺傳自父母等。對(duì)所發(fā)現(xiàn)的CNVs的解釋成為實(shí)驗(yàn)室診斷及咨詢(xún)?nèi)藛T的最大挑戰(zhàn)，僅從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出的結(jié)論沒(méi)有準(zhǔn)確的規(guī)律可循，因此主觀正確評(píng)估十分必要。
總體來(lái)講，第二代測(cè)序使時(shí)效與通量均獲得增加，實(shí)現(xiàn)了快速產(chǎn)前診斷;增加了診斷精度，可實(shí)現(xiàn)染色體微小結(jié)構(gòu)異常的診斷和多種出生缺陷的分子產(chǎn)前診斷，將多種技術(shù)平臺(tái)組合應(yīng)用，提高了產(chǎn)前診斷水平。
對(duì)于高齡婦女生育，遺傳咨詢(xún)和指導(dǎo)要貫穿于生育的全過(guò)程，結(jié)合上述產(chǎn)前診斷方法為高齡婦女生育風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供科學(xué)的指導(dǎo)。
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