探討稀土上納米粒子與細(xì)胞的相互作用機(jī)制論文
上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料是一種由低能量的近紅外光激發(fā)發(fā)射出高能量可見光的發(fā)光材料，大部分是鑭系元素?fù)诫s的上轉(zhuǎn)換納米粒子。上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料有很多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn): 毒性小、化學(xué)穩(wěn)定性高、光穩(wěn)定性好、發(fā)射和吸收帶狹窄、熒光壽命長，另外由近紅外激發(fā)發(fā)光有較深的光穿透深度、對生物樣本和生物組織幾乎無損傷、無背景熒光、耐光漂白。這些優(yōu)異的特性使上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子在生物熒光標(biāo)記染料、藥物載體和以能量共振轉(zhuǎn)移為基礎(chǔ)的生物檢測等醫(yī)用領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。納米粒子安全高效的進(jìn)入細(xì)胞是這些應(yīng)用成功實(shí)現(xiàn)的關(guān)鍵。然而，關(guān)于上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子與細(xì)胞相互作用的研究尚未見報(bào)道。因此，本文對稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子與細(xì)胞相互作用的機(jī)制做了初步的研究。
上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料中發(fā)光效率最高的是稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子，其中的佼佼者是離子對Yb3 + /Er3 + 或Yb3 + /Tm3 + 摻雜的NaYF4納米粒子。據(jù)此，本文選用了兩種類型的稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子進(jìn)行研究。第一種是根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道合成的巰基丁二酸修飾的親水性上轉(zhuǎn)換NaYF4: Yb3 +，Er3 + 納米粒子( HMNPs) 。第二種是由本課題組合成的氨基修飾的親水性上轉(zhuǎn)換NaYF4:Yb3 +，Er3 + 納米粒子( HINPs) 。這兩種粒子的物理化學(xué)性質(zhì)相近，但表面電荷極性不同。HMNPs 因表面包覆巰基而帶負(fù)電，HINPs 因表面接氨基而帶正電。HMNPs 是文獻(xiàn)報(bào)道中比較常用的一種稀土上轉(zhuǎn)換納米粒子因此很具代表性，而帶有正電的HINPs 可以從另一個(gè)角度反映上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子與細(xì)胞的相互作用機(jī)制。
1 實(shí)驗(yàn)
1. 1 試劑和儀器
高糖培養(yǎng)基( DMEM) ，胎牛血清( FBS) 和0. 25%胰蛋白酶，Gibco; 1% 雙抗，磷酸緩沖鹽溶液( PBS) ，Hyclone; 曲拉通X-100，Aladdin。GATAN 832. 20B 透射電鏡; RF-5301 熒光分光光度計(jì); Zetasizer Nano Seriesa ZEN4602 納米粒度電位儀; BD FACS Calibur 流式檢測儀; LeicaTCS SP8 共聚焦檢測儀; Dimension Icon，BrukerAXS 原子力顯微鏡。
1. 2 細(xì)胞培養(yǎng)
MDA-MB-231 細(xì)胞在完全培養(yǎng)基( 高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基∶ 胎牛血清∶ 雙抗= 89∶ 10∶ 1) ，37 ℃，5% CO2的條件下培養(yǎng)。
1. 3 流式細(xì)胞檢測
將2 mL 密度為1 × 105 個(gè)·mL - 1 的細(xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)10 h，然后將培養(yǎng)基吸掉，用PBS 清洗3 次，加入濃度為100 μg·mL - 1 HINPs 或HMNPs 粒子的分散液，分別放在三種不同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng): 37 ℃( 常規(guī)條件) ，低溫4 ℃和曲拉通X-100 ( Triton X-100) 。
37 ℃條件下，粒子的分散液是將納米粒子原液添加到完全培養(yǎng)基制得，用其替換原培養(yǎng)基后放在37 ℃，5% CO2的條件下接著培養(yǎng)。低溫4 ℃條件下，將粒子原液加入完全培養(yǎng)基得到分散液，用其替換原培養(yǎng)基放在低溫4 ℃的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。曲拉通X-100 條件下，將粒子原液添加到含曲拉通X-100( 體積分?jǐn)?shù)為0. 0033%) 的完全培養(yǎng)基得到分散液，用其替換原培養(yǎng)基放在37 ℃，5%CO2的條件下繼續(xù)培養(yǎng)。
每種條件下細(xì)胞都分別繼續(xù)培養(yǎng)1，3，5 和10 h，然后將含粒子的培養(yǎng)基吸出，用PBS 清洗3次，用0. 5 mL 0. 25%的胰酶消化4 min，后用2 mL的完全培養(yǎng)基終止消化，將其放入離心管以1000r·min - 1的速度離心5 min 得到細(xì)胞，向離心管內(nèi)加入3 mL PBS 將細(xì)胞吹打均勻后再離心5 min，最后將得到的細(xì)胞分散在500 μL 的PBS 中做流式檢測。每次至少測量10000 個(gè)細(xì)胞后再計(jì)算細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。
1. 4 共聚焦成像
將2 mL 密度為2. 5 × 104 個(gè)·mL - 1 的細(xì)胞懸液接種在含直徑為20 mm 玻片的35 mm 的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)方式和培養(yǎng)條件與做流式檢測的實(shí)驗(yàn)相同，不同之處在最后樣品處理的過程。細(xì)胞在含粒子的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)1，3，5，10 h后，用PBS 清洗3 次，最后向培養(yǎng)皿中加入1 mL 的PBS，接著進(jìn)行共聚焦檢測。
1. 5 原子力顯微鏡檢測( AFM)
在研究表面活性劑對上轉(zhuǎn)換納米粒子與細(xì)胞相互作用影響之前，我們先用原子力顯微鏡做了一些前期實(shí)驗(yàn)來研究表面活性劑對細(xì)胞形態(tài)的影響。培養(yǎng)皿中加入2 mL 密度為3. 25 × 104個(gè)·mL - 1的細(xì)胞培養(yǎng)10 h。將培養(yǎng)基替換成含有0. 0033% 曲拉通X-100 的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10 h。用PBS 將細(xì)胞清洗3 次，接著用3% 的甲醛溶液在4 ℃固定2 h，用PBS 清洗5 次，后依次用10%，30%，40%，60%，70%，80%，90% 和100%的乙醇處理5 min 脫水。最后樣品用原子力顯微鏡進(jìn)行檢測。
2 結(jié)果和討論
HINPs 和HMNPs 是平均粒徑為30 nm 的近似六邊形的親水性稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子，HINPs因表面氨基帶正電，HMNPs 因表面巰基帶負(fù)電。稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子可以由低能量近紅外光激發(fā)發(fā)射出高能量的可見光，所以進(jìn)行體內(nèi)或體外的熒光檢測時(shí)，可直接使用上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子而不需要標(biāo)記熒光染料。由于沒有熒光染料釋放到體內(nèi)環(huán)境，所以用這種材料進(jìn)行熒光成像和流式檢測時(shí)會(huì)獲得更準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。雖然HINPs和HMNPs 的表面基團(tuán)不同，但是濃度相同的HINPs 和HMNPs 溶液由激發(fā)光980 nm 激發(fā)發(fā)射的熒光強(qiáng)度基本相近，所以細(xì)胞熒光成像時(shí)不會(huì)因熒光強(qiáng)度的不同造成巨大的成像差異。HINPs 和HMNPs 在三種不同的培養(yǎng)環(huán)境中與細(xì)胞相互作用，包括37 ℃( 常規(guī)條件) ，低溫4 ℃和曲拉通X-100。通過使用共聚焦成像和流式檢測兩種檢測手段對細(xì)胞進(jìn)行表征。
2. 1 HINPs 與細(xì)胞相互作用的探究
2. 1. 1 37 ℃常規(guī)條件
37 ℃條件下，將細(xì)胞放在含有100 μg·mL - 1HINPs 的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間。由共聚焦圖3 可以看到，1 h 時(shí)幾乎沒有HINPs 進(jìn)入細(xì)胞，大部分的顆粒粘附在細(xì)胞膜上。3 h 后，大量顆粒進(jìn)入細(xì)胞，使得細(xì)胞熒光強(qiáng)度有了顯著提高。5 和10h 后，顆粒更加均勻地分布在細(xì)胞內(nèi)，吸附在細(xì)胞膜上的顆粒少。隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞熒光強(qiáng)度整體上有增加的趨勢。通過使用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞熒光強(qiáng)度做定量檢測，由圖4可知細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的確隨著時(shí)間的推移而增長，3 h 內(nèi)顆粒進(jìn)入細(xì)胞的速度最快，此后粒子進(jìn)入細(xì)胞的數(shù)量增長緩慢且逐漸趨于平衡。另外，細(xì)胞內(nèi)有顯著的點(diǎn)狀熒光分布格局，可以推論HINPs 是被囊泡包裹進(jìn)入細(xì)胞。
2. 1. 2 低溫4 ℃
4 ℃條件下 4 ℃的條件下基本沒有HINPs 進(jìn)入細(xì)胞。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道在4 ℃的培養(yǎng)條件下為細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)提供能量的途徑會(huì)受到抑制，從而阻礙胞吞和胞吐等需消耗能量的跨膜運(yùn)輸方式。因此可以推論出細(xì)胞對HINPs 的攝取需要消耗能量。
2. 1. 3 曲拉通X-100
將細(xì)胞在含HINPs 和曲拉通X-100 的完全培養(yǎng)基的條件下培養(yǎng)，進(jìn)一步探究HINPs 的轉(zhuǎn)運(yùn)是否與膜蛋白有關(guān)。曲拉通X-100 作為一種非離子去污劑，可以破壞蛋白質(zhì)-脂質(zhì)以及脂質(zhì)-脂質(zhì)之間的連接，但不破壞蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的連接，使蛋白質(zhì)從細(xì)胞膜上溶解和分離。曾有研究表明當(dāng)曲拉通X-100 的濃度低于0. 15 mmol·L - 1 時(shí)，細(xì)胞膜的通透性沒有變化且不影響細(xì)胞活性。為了證明這一點(diǎn)我們先做了預(yù)實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞放在含0. 0033%( 0. 04 mmol·L - 1 ) 曲拉通X-100 的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 h，用AFM 進(jìn)行檢測。在沒有加曲拉通X-100 的空白對照組中，統(tǒng)計(jì)了50 處不同位置不同細(xì)胞剖面高度的數(shù)值，得出對照組細(xì)胞膜的平均高度差為81 nm 。在曲拉通X-100 處理過的實(shí)驗(yàn)組中，統(tǒng)計(jì)了50 處不同位置不同細(xì)胞剖面高度的數(shù)值，得出對照組細(xì)胞膜的平均高度差為193 nm。實(shí)驗(yàn)組的高度差要遠(yuǎn)大于對照組的高度差，說明曲拉通X-100 確實(shí)能在細(xì)胞保持活性的情況下使細(xì)胞膜產(chǎn)生孔洞。將細(xì)胞在含HINPs 與0. 0033% 曲拉通X-100的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)看不到綠色熒光與37 ℃ 條件含HINPs 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞相比，在僅是添加了曲拉通X-100 的情況下就導(dǎo)致了細(xì)胞內(nèi)沒有綠色熒光的出現(xiàn)，即無納米粒子的進(jìn)入。通過前面對曲拉通X-100 作用的討論可知，雖然細(xì)胞膜上出現(xiàn)一些空洞，但細(xì)胞仍然�；钚�、細(xì)胞膜的.整體構(gòu)架完整且通透性沒有變化，由此可推論出曲拉通X-100 主要影響的是膜蛋白的活性，甚至使得膜蛋白與細(xì)胞膜分離。因此HINPs 納米粒子未能進(jìn)入細(xì)胞，可以理解為由于膜蛋白的失活或缺失而導(dǎo)致納米粒子不能進(jìn)入細(xì)胞。因此，膜蛋白在HINPs 的跨膜過程中有著非常重要的作用。
通過對37 ℃，4 ℃和曲拉通X-100 三種條件的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析可推出HINPs 進(jìn)入細(xì)胞應(yīng)該先與細(xì)胞膜上的受體蛋白結(jié)合，導(dǎo)致膜凹陷，繼而形成內(nèi)吞囊泡進(jìn)入細(xì)胞。這一過程也稱為消耗能量的受體介導(dǎo)的胞吞運(yùn)輸方式。
2. 2 HMNPs 與細(xì)胞相互作用的探究
為了從另一個(gè)角度探究上轉(zhuǎn)換納米粒子與細(xì)胞的相互作用，我們采用另一種表面帶負(fù)電的HMNPs 納米粒子做相同的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行對比。HMNPs與HINPs 細(xì)胞熒光強(qiáng)度的變化在總體趨勢上沒有明顯的區(qū)別。在37 ℃ 條件下培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞攝取HMNPs 的量是最大的。在其它情況下基本沒有粒子進(jìn)入細(xì)胞。HMNPs 進(jìn)入細(xì)胞的過程同樣是一種消耗能量的受體介導(dǎo)的胞吞運(yùn)輸方式。雖然HMNPs 與HINPs 的運(yùn)輸方式相同，但是由共聚焦看到HMNPs 的細(xì)胞熒光強(qiáng)度要比HINPs 的細(xì)胞熒光強(qiáng)度弱，即HMNPs 進(jìn)入細(xì)胞的量要小于HINPs 的進(jìn)入量。兩種粒子各自相對熒光強(qiáng)度圖，計(jì)算方法是將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)組與空白對照組的細(xì)胞熒光強(qiáng)度相減得到差值，后將每個(gè)差值除以1 h 的差值得到相對強(qiáng)度。這樣排除了粒子熒光發(fā)光強(qiáng)度不同的因素，可以直接定量得出正常條件下細(xì)胞對HMNPs 的攝取量的確遠(yuǎn)低于對HINPs的攝入量，說明帶正電的HINPs 更容易和帶負(fù)電的細(xì)胞膜結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞。
3 結(jié)論
表面包覆氨基而帶正電的HINPs 和包覆巰基帶負(fù)電的HMNPs 是兩種典型的稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子。通過研究發(fā)現(xiàn)，37 ℃條件下這兩種納米粒子在10 h 內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞的數(shù)量呈逐漸增加的趨勢，并且呈顯著的點(diǎn)狀熒光分布。由此表明這些納米粒子是以囊泡包裹的方式進(jìn)入細(xì)胞的。低溫4 ℃時(shí)細(xì)胞內(nèi)消耗能量的轉(zhuǎn)運(yùn)方式受到抑制而此時(shí)粒子基本未進(jìn)入細(xì)胞，說明細(xì)胞對這些粒子的攝取是消耗能量的過程。適量曲拉通X-100 能在細(xì)胞保持活性的狀態(tài)下使膜蛋白失活甚至脫落，此種條件下也沒有粒子進(jìn)入細(xì)胞，證明膜蛋白在納米粒子的轉(zhuǎn)運(yùn)中有著重要的作用。綜上所述可推斷HINPs和HMNPs 的跨膜是一種能量消耗的受體介導(dǎo)的胞吞運(yùn)輸方式。另一方面，帶正電的HINPs 相較于帶負(fù)電的HMNPs 更容易與細(xì)胞膜相互作用進(jìn)入細(xì)胞，表明帶正電的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子作為運(yùn)輸藥物的載體會(huì)更有優(yōu)勢。由共聚焦成像和流式檢測可知HINPs 在細(xì)胞內(nèi)受激發(fā)射出很強(qiáng)的熒光，證明這種材料能夠成為優(yōu)異的體內(nèi)成像材料。通過對上述研究的分析，我們相信這項(xiàng)工作會(huì)為探究上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子與細(xì)胞相互作用的機(jī)制開啟新思路，為設(shè)計(jì)安全高效的納米藥物載體和體內(nèi)成像材料提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
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