神經(jīng)內(nèi)科畢業(yè)論文
復(fù)方六月雪（CLYX）是通過長時期的民間臨床觀察而擬定的治療急慢性乙型肝炎和肝硬化的驗方，主要由廣西民間草藥六月青、白花蛇舌草、梔子花根等組成，本課題組前期大量的實驗研究表明，該方可有效地抑制鴨乙型肝炎病毒DNA 和HepG2.2.15細(xì)胞HBV DNA的'復(fù)制［2，6，8］；無毒濃度的CLYX在HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中可有效地抑制細(xì)胞HBV DNA的復(fù)制及HBsAg（乙型肝炎表面抗原）和HBeAg（乙型肝炎E抗原）的分泌［3，7］；此外，CLYX對CCl4、AP、D-Gal所致小鼠急性化學(xué)性肝損傷均有明顯的保護(hù)作用，并由此推測其保肝作用可能與誘導(dǎo)肝藥酶有關(guān)［4］。
1 材料與儀器
1.1 藥物六月青總皂苷，由廣西醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室和廣西醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗中心自行提取。
1.2 動物Wistar大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量（250±10）g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。
1.3 細(xì)胞株HepG2.2.15細(xì)胞株，購自北京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病毒研究所，本室自行傳代，定期用G418篩選。
1.4 試劑阿昔洛韋（Aciclovir ACV）：湖南迪諾制藥有限公司醫(yī)藥工業(yè)研究所產(chǎn)品，批號： 20070518；RPMI1640培養(yǎng)基：美國Gibco公司，Cat№21202-016；胎牛血清：美國Gibco公司，Cat№21607-042；G418：美國Sigma公司，Cat№228527-72；HBV DNA熒光定量PCR試劑盒：深圳匹基生物工程股份有限公司，批號：20070613。
1.5 儀器iCycler FQ實時熒光定量PCR儀：美國Bio-Rad公司；CO2孵箱：美國Thermo Forma公司，Model311。
2 方法
2.1 六月青總皂苷的制備六月青粗粉1.0 kg，加10倍量80%乙醇回流提取3次，1.5 h/次，減壓回收乙醇至無醇味，分別用石油醚、氯仿、醋酸乙酯萃取，棄去有機(jī)溶劑萃取液，最后再用水飽和正丁醇萃取，取正丁醇萃取液減壓濃縮至干，得到41.28 g浸膏，上處理好的AB-8型大孔樹脂柱（40 mm×800 mm），分別用6BV的30%乙醇和50%乙醇洗脫，收集醇洗脫液，減壓回收乙醇， 60℃的減壓恒溫干燥箱中干燥得4.28 g淡黃色化合物，經(jīng)常規(guī)化學(xué)定性試驗證實為皂苷類，利用香草醛-硫酸分光光度法測定總皂苷含量［5］，純度為85.8%。
2.2 TLYQ含藥血清的制備3月齡Wistar大鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只。①空白對照組：予等量的生理鹽水；②陽性對照組：ACV 0.1×10-3 g·kg-1·d-1；③TLYQH組：28.2×10-3 g·kg-1·d-1（相當(dāng)于生藥6.6 g. kg-1·d-1）；④TLYQM組：14.1×10-3 g·kg-1·d-1（相當(dāng)于生藥3.3 g·kg-1·d-1）；⑤TLYQL組：7.1×10-3 g·kg-1·d-1（相當(dāng)于生藥1.7 g·kg-1·d-1）。各組動物在同樣條件下飼養(yǎng)，均以2次/d，早晚各1次空腹灌胃，連續(xù)給藥7 d。于末次灌胃（灌胃前禁食不禁水12 h）后2 h，乙醚吸入麻醉，腹主動脈抽血，低速離心分離血清，并將每組動物的血清混合。經(jīng)56℃ 30 min滅活處理，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜，再經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
2.3 熒光定量PCR（FQ-PCR）法檢測HBV DNA取HepG 2.2.15細(xì)胞1瓶，用胰酶消化后制備成單細(xì)胞懸液，計數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度至2×104 cell·ml-1，加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔900 μl，置CO2孵箱（37℃，5%CO2）中培養(yǎng)24 h后，分別加入各組含藥血清100 μl，每個濃度3個復(fù)孔。以等量的完全培養(yǎng)液為空白對照。連續(xù)培養(yǎng)72 h后，分別吸出上清液于1.5 ml滅菌Eppendor管中， -20℃保存，統(tǒng)一待檢。再次加入上述含藥血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，分別吸出上清液于1.5 ml滅菌Eppendorf管中， -20℃保存，統(tǒng)一待檢。 按試劑盒方法提取樣品HBV DNA。HBV DNA定量標(biāo)準(zhǔn)品由深圳匹某公司直接提供。各反應(yīng)管放入FQ-PCR儀，按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增：94℃預(yù)變性1 min，95℃變性5 s，60℃退火、延伸20 s。共反應(yīng)42個循環(huán)。擴(kuò)增過程及熒光信號檢查、數(shù)據(jù)的儲存和分析均由儀器及其自帶的軟件自動完成。
3 結(jié)果
藥復(fù)方成分非常復(fù)雜，其組方配伍多數(shù)是以某一味藥為主其余為輔，諸藥發(fā)揮協(xié)同治療作用。為了能更好地保證CLYX療效穩(wěn)定性，本研究對該方中的君藥（六月青）進(jìn)行研究，即從六月青提取分離出總皂苷活性部位，并對其進(jìn)行抗HBV藥效學(xué)研究，篩選出該方有效活性部位，進(jìn)而為下一步分離純化有效化學(xué)成分，建立處方質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)提供實驗依據(jù)。是六月青主要活性部位之一。
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