詳談貴州鳳崗綠茶對小鼠抗氧化抗衰老的作用論文
貴州為我國綠茶的主要省份，而鳳岡產(chǎn)茶歷史悠久。唐代茶圣陸羽在他撰寫的世界第一部茶書《茶經(jīng)》八之出中記述:“黔中生思州、播州、費州、夷州……，往往得之，其味極佳”。據(jù)考證，夷州治所就是今鳳岡縣綏陽鎮(zhèn)。宋代《華陽國志》中“平夷產(chǎn)茶蜜”，樂史《太平寰宇記》“夷州、播州、思州以茶為貢”和清代《梅移隨筆》“龍泉產(chǎn)云霧芽茶，色味雙絕”中的夷州、思州、龍泉都是指今鳳岡一帶。最新科學(xué)研究表明，富鋅富硒綠茶中所含有的天然物質(zhì)成分對防衰老、防癌、抗癌、殺菌、消炎等均有特殊效果，為其他茶類所不及。筆者通過測定肝臟組織中SOD 和GSH-Px 的mRNA 及其蛋白質(zhì)表達(dá)水平，研究富鋅富硒綠茶對D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老小鼠的抗氧化、抗衰老作用，為貴州特色茶葉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和推廣提供營養(yǎng)保健的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
1 材料與方法
1. 1 試驗材料和儀器
1. 1. 1 動物。昆明雄性小鼠70 只，體重(18 ～ 25 g)，購自貴陽醫(yī)學(xué)院動物中心(合格證:10000S38)。
1. 1. 2 藥物。供試富硒富鋅綠茶由貴州鳳岡縣永安鎮(zhèn)田壩村所產(chǎn)，2013 年春季采摘。經(jīng)貴州省山地研究所測試中心測定，該綠茶含鋅、硒含量分別是65. 47 ± 0. 02、1. 74 ± 0. 02 mg /kg。按茶水比為2 g∶20 ml 的比例，用沸水沖泡30 min 制成茶水，過濾，為高濃度組;稀釋1 倍過濾后為中濃度組;再量取等體積水稀釋，過濾后為低濃度組;普通綠茶泡制方法同前;維生素C 片劑，用濃度0. 9% 生理鹽水配制成50 g /ml溶液。
1. 1. 3 試劑。D-半乳糖由上海恒信化學(xué)試劑廠生產(chǎn);動物組織總RNA 提取試劑盒(天根，批號DP121221);Thermo 試劑盒(Fermentas 公司);6 × DNA 電泳Loading Buffer 上樣液(天根，批號BC110413);溴化乙錠(EB) 溶液( 天根，批號BC120227);DNA marker(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司生產(chǎn)，批號CW0632);濃度30%丙烯酰胺(賽蘭博，批號8080);1. 5 mol /L Tris(pH 8. 8);1. 0 mol /L Tris(pH 6. 8);濃度10%SDS;濃度10%過硫酸胺(APS);TEMED;BAC 法蛋白定量試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司);兔抗小鼠SOD-1 多克隆抗體(Santa Cruz 公司，批號sc-11407);兔抗小鼠GSH-1 多克隆抗體(Santa Cruz 公司，批號sc-292189);辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Santa Cruz 公司，批號sc-2004)。
1. 1. 4 儀器。凝膠成像分析儀(美國Bio-Rad 公司)，酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek 公司)，電泳儀( 美國Bio-Rad 公司)，3k15高速冷凍離心機(德國Sigma 公司)，T148 050-900 型PCR 儀(德國Biometra 公司)，水平電泳儀( 美國伯樂BIO-RAD 公司)，Dolphin-Doc 凝膠成像系統(tǒng)和Dolphin-ID 軟件( 美國Wealtec 公司)，高壓滅菌鍋(日本三洋公司)，MP200A 型電__子天平(上海良平儀器廠)，電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠)，Morris 水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所)，動物運動軌跡記錄分析系統(tǒng)(普升科技有限公司)，HPLAS-2000 計算機圖像分析系統(tǒng)(無憾千屏公司)。
1. 2 試驗方法
1. 2. 1 動物衰老模型的構(gòu)建。用濃度75% 乙醇消毒小鼠下腹部，用D-半乳糖(0. 2 mg /g 小鼠體重)腹腔注射，連續(xù)14d，誘發(fā)衰老模型，之后連續(xù)28 d 每日給予相同劑量以維持衰老模型�？瞻捉M小鼠注射濃度0. 9% 生理鹽水(0. 1ml /10 g小鼠體重)，給藥方法同模型組。
1. 2. 2 行為學(xué)測試(游泳水迷宮試驗)。在連續(xù)灌胃21 d后，采用環(huán)形水池。水池中放一低于水面1 cm 左右的逃避平臺。模型小鼠預(yù)先訓(xùn)練4 d，每次取1、2、3、4 四個象限入水點背對站臺放入水池。若小鼠在60 s 內(nèi)找到平臺，則使其停留15 s;若60 s 內(nèi)未找到平臺，則將其誘導(dǎo)到平臺上，并停留15 s 方結(jié)束一次訓(xùn)練。連續(xù)訓(xùn)練4 d，在第5 天進行行為學(xué)測試，其檢測指標(biāo)有:①定向航行試驗，測定每只小鼠從放入水中開始到跳到逃避平臺時的時間，即逃避潛伏期;②空間探索試驗，測定每只小鼠穿越平臺區(qū)所用時間及穿越站臺次數(shù)。
1. 2. 3 分組與給藥。小鼠分為空白組、衰老模型組、普通綠茶組、富鋅富硒綠茶(高、中、低劑量)組、陽性對照組(維生素C 片)，每組10 只小鼠。給藥方案為:給予D-半乳糖(0. 2mg /g)14 d 后，普通綠茶組給予普通綠茶茶水灌胃;富鋅富硒綠茶組按照高、中、低濃度進行灌胃;模型組、空白組給予等容積蒸餾水灌胃;陽性對照組灌胃1 g /L 維生素C 溶液，1次/d，連續(xù)給藥28 d。
1. 2. 4 小鼠肝臟組織SOD、GSH-Px 蛋白質(zhì)表達(dá)水平的檢測。提取肝臟組織總蛋白，取少量上清液進行蛋白定量，余下- 20℃保存?zhèn)溆�，制膠，然后取20 μl 蛋白質(zhì)樣品加上樣緩沖液，煮沸變性后進行SDS-PAGE 電泳;電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜;用含濃度5%脫脂奶粉的TBST 振蕩封閉2 h;分別加入適量一抗4 ℃封閉過夜，次日以TBS-T 洗膜3 次，每次10 min;加二抗，室溫振搖孵育2 h;洗膜后ECL 法顯影。以β-actin 為內(nèi)參，條帶經(jīng)Kodok Digital Science ID Image Analysis Software 及GDS-1 數(shù)字化凝膠成像分析儀掃描，計算吸光度(A)。A 比值= 目的蛋白A/β-actinA式中，A 比值為目的蛋白表達(dá)量的相對含量。試驗重復(fù)3 次，取平均值。
1. 2. 5 小鼠肝臟組織SOD、GSH-Px mRNA 表達(dá)水平的檢測。用動物組織總RNA 提取試劑盒提取小鼠肝臟組織總RNA，提取后取5 μl RNA 對RNA 純度、濃度進行檢測(提取方法嚴(yán)格按照說明書進行)。RT-PCR 引物設(shè)計依據(jù)昆明小鼠中的SOD 和GSH-PxmRNA 序列和β-actin mRNA 序列設(shè)計，經(jīng)blast 進行特異性確定。最后，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物。SOD mRNA 上游引物:5’-CTGTACCAGTGCAGGACCTCAT-3’，下游引物:5’-CACCTTTGCCCAAGTCATCTT-3’。該引物擴增的片段長度為221 bp。GSH-Px mRNA 上游引物:5’-GAAGTGCGAAGTGAATGGTGAGA-3’，下游引物:5’-AGTTGCCAGACTGCTGGGACA-3’。該引物擴增的片段長度為269bp。β-actin mRNA 上游引物: 5’-ATATCGCTGCGCTGGTCGTC-3’，下游引物: 5’-AGGATGGCGTGAGGGAGAGC-3’。該引物擴增的片段長度為541 bp。將提取的RNA 逆轉(zhuǎn)錄(RT-PCR) 成cDNA，方法參考Fermentas 公司RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 說明書。然后，以cDNA 為模板，以SOD、GSH-Px 和β-actin 引物分別進行PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)體系為:ddH2O 6 μl，2 ×Taq PCR MasterMix 13 μl，上下引物各1 μl，上下內(nèi)參各1 μl，模板2 μl。PCR 擴增反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。產(chǎn)物在PCR 反應(yīng)結(jié)束后電泳，結(jié)果掃描保存。1. 2. 6 統(tǒng)計學(xué)處理。數(shù)據(jù)采用SPSS 17. 0 系統(tǒng)軟件進行處理。計量資料采用單因素方差分析和多重比較，P < 0. 05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果與分析
2. 1 小鼠衰老模型驗證
2. 1. 1 小鼠外觀。研究表明，空白組小鼠體質(zhì)量正常增加;模型組小鼠從造模第28 天開始，體重增加速度下降，部分毛發(fā)脫落、失去光澤，出現(xiàn)行動遲緩、精神萎靡不振等癥狀;富鋅富硒綠茶高劑量組小鼠精神狀態(tài)好于普通綠茶組;富鋅富硒綠茶中劑量組小鼠精神一直良好，毛發(fā)光滑整齊，體重增長速度正常;富鋅富硒綠茶低劑量組小鼠精神狀態(tài)略好于高劑量組小鼠;普通綠茶組小鼠表現(xiàn)與空白組相似;陽性組小鼠表現(xiàn)與中劑量組相似。
2. 1. 2 小鼠血清驗證。通過對比模型組與空白對照組，發(fā)現(xiàn)模型組小鼠血清中MDA 含量在0. 05 水平顯著升高，而血清中SOD 活力、GSH-Px 活力、過氧化氫酶(CAT) 活力顯著降低。
2. 1. 3 行為學(xué)測試結(jié)果。由表1 可知，在定向航行試驗中，與空白組相比，模型小鼠所用的逃避潛伏期較長(P < 0. 01);普通綠茶組所用的逃避時間與空白組相差不大(P > 0. 05);與普通綠茶組相比，富鋅富硒綠茶組所用的逃避潛伏期較短(P < 0. 01);與陽性對照組相比，富鋅富硒綠茶中劑量組所用的逃避潛伏期與之相當(dāng)(P > 0. 05);與模型組相比，富鋅富硒綠茶組所用的逃避潛伏期明顯縮短(P < 0. 01)。在空間探索試驗中，與空白組相比，模型組第1 次穿越平臺區(qū)所用時間延長，穿越站臺次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義( P<0. 1="" p="">0. 05); 與普通綠茶組相比，富鋅富硒綠茶組第1 次穿越平臺區(qū)所用時間縮短，穿越站臺次數(shù)增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0. 01);與陽性對照組相比，富鋅富硒綠茶中劑量組第1 次穿越平臺區(qū)所用時間和穿越站臺次數(shù)與之相差不大(P > 0. 05);與模型組相比，富鋅富硒綠茶組第1 次穿越平臺區(qū)所用時間縮短，穿越站臺次數(shù)明顯增多(P < 0. 01)。
2. 2 富鋅富硒綠茶對衰老模型小鼠肝臟組織SOD、GSH-Px蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響
模型組蛋白表達(dá)低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0. 01);富鋅富硒綠茶高、中、低劑量組蛋白表達(dá)高于衰老模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0. 01);富鋅富硒綠茶高劑量組蛋白表達(dá)低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0. 05);富鋅富硒綠茶中劑量組蛋白表達(dá)高于高、低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0. 05);富鋅富硒綠茶組蛋白表達(dá)高于普通綠茶組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0. 01)。
2. 3 富鋅富硒綠茶對衰老模型小鼠肝臟組織SOD、GSH-PxmRNA 表達(dá)水平的影響
模型組mRNA 表達(dá)低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0. 01);高、中、低劑量組mRNA 表達(dá)高于衰老模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0. 01);高劑量組mRNA 表達(dá)低于低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0. 05);中劑量組mRNA 表達(dá)高于高、低劑量組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0. 05);富鋅富硒綠茶組mRNA 表達(dá)高于普通綠茶組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0. 01)。
3 討論
富鋅富硒綠茶中含有鋅和硒2 種微量元素。鋅元素是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶超氧化物歧化酶的輔基;硒元素是谷胱甘肽過氧化物酶的必需成分，每摩爾GSH-Px 含有4 g 硒原子。因此，富鋅富硒綠茶可以為機體抗氧化物質(zhì)提供豐富的原材料。
研究表明，SOD 和GSH-Px 是機體抗氧化系統(tǒng)中2 種重要的抗氧化酶。其中，SOD 對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，能夠有效清除自由基，減輕脂質(zhì)過氧化，保護細(xì)胞免受損傷。趙會杰等通過D-半乳糖所致衰老小鼠飼喂SOD 蘋果，發(fā)現(xiàn)可顯著提高小鼠血清和肝臟組織的SOD、CAT 和GSH-Px 活性，抑制脂質(zhì)過氧化，降低MDA 含量。GSH-Px 則是機體內(nèi)重要的分解過氧化物的含硒酶。GSH-Px 的酶活力可以作為衡量機體硒抗氧化的能力。在體內(nèi)，SOD 將超氧自由基O2- 轉(zhuǎn)化為H2O2，GSH-Px 進一步將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O 和O2，并且通過減少過氧化物對SOD 的損害增加SOD 的活性。SOD 和GSH-Px 兩者之間明顯存在著相互保護作用和協(xié)同抗氧化作用。還有研究通過測定SOD 活性，推測其改善學(xué)習(xí)記憶作用可能與其提高體內(nèi)SOD活性有關(guān)，其活力間接反映機體保護細(xì)胞免受損傷的.抗氧化能力。
研究中，通過皮下注射D-半乳糖，在體內(nèi)代謝過程中產(chǎn)生過量的超氧陰離子自由基O2- 和H2O2，引起代謝紊亂，進而提高體內(nèi)自由基水平及過氧化體內(nèi)組織制造和自然衰老類似的亞急性衰老模型。同時，以此為模型，研究貴州鳳岡富鋅富硒綠茶對小鼠的抗氧化作用。通過觀察小鼠外觀、血清學(xué)試驗和行為學(xué)測試結(jié)果，發(fā)現(xiàn)造模成功。在小鼠行為學(xué)測試中，發(fā)現(xiàn)富鋅富硒綠茶中劑量組的抗氧化作用最佳，提高小鼠的學(xué)習(xí)能力，延緩小鼠的衰老。
該試驗結(jié)果進一步表明，富鋅富硒綠茶可明顯提高D-半乳糖所致衰老小鼠肝臟組織中SOD、GSH-Px mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。富鋅富硒綠茶可通過改變SOD、GSH-Px 的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，導(dǎo)致小鼠肝臟和血清中SOD、GSH-Px 含量增加，提高酶活力，在一定程度上增加抗氧化的能力，減慢細(xì)胞衰老的速度，達(dá)到改善衰老的作用。抗氧化生化指標(biāo)與水迷宮空間記憶能力試驗中定向航行和空間探索試驗結(jié)果相一致。另外，研究表明，中濃度富鋅富硒綠茶劑量抗氧化效果更佳，原因還有待進一步研究。總之，貴州鳳岡富鋅富硒綠茶具有清除自由基、抗氧化等作用，改善衰老的行為學(xué)特征，延緩衰老的進程。
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