本科生專業(yè)畢業(yè)論文
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【摘 要】
目的研究還原型谷胱甘肽對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(A/R)損傷的影響。方法建立心肌細(xì)胞A/R損傷模型，隨機(jī)分為5組：A組，正常對(duì)照組;B組，單純?nèi)毖?復(fù)氧(A/R低氧2h，復(fù)氧1h)組;C、D、E組為還原型谷胱甘肽處理組，加入還原型谷胱甘肽(GSH)分別使其終濃度為40、80、160mg/L，后A/R。于復(fù)氧后測(cè)定各組培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)變化及細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量和細(xì)胞存活率。結(jié)果與正常組相比，單純低氧/復(fù)氧組LDH漏出量、MDA水平顯著升高(P<0.01)，細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01)。與缺氧/復(fù)氧組比較，各谷胱甘肽處理組上述變化明顯減輕(P<0.05)。結(jié)論還原型谷胱甘肽對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞A/R損傷具有保護(hù)作用，并具有濃度依賴性。
【關(guān)鍵詞】
還原型谷胱甘肽,心肌細(xì)胞,缺氧,復(fù)氧
1材料與方法
1.1材料實(shí)驗(yàn)用1～3天的Wistar大鼠乳鼠，山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄不拘;DMEM培養(yǎng)基由愛(ài)博公司出品;胎牛血清為美國(guó)Gibco公司出品;胰酶為Sigma公司出品;丙二醛(MDA)，乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物研究所;還原型谷胱甘肽(古拉定)由LaboratorioFarmaceuticoC.T.S.R.1生產(chǎn)(批號(hào)：4027)。
1.2乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)菌取出生1～3天大鼠乳鼠心臟，剪碎后用0.25%胰酶消化4～5次，取除第1次以外的上清，用含15%胎牛血清的高糖DMEM中止消化，離心取心肌細(xì)胞沉淀，加入培養(yǎng)液，集中混勻制成懸液，應(yīng)用差速貼壁法分離純化心肌細(xì)胞，以5×105/ml的培養(yǎng)密度接種于24孔培養(yǎng)板中，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后換液。
1.3實(shí)驗(yàn)分組及操作程序試驗(yàn)分為5組，每組重復(fù)8孔，A組為正常對(duì)照組(培養(yǎng)板置培養(yǎng)箱中持續(xù)孵育3h結(jié)束實(shí)驗(yàn));B組為單純?nèi)毖?復(fù)氧組(A/R缺氧2h，復(fù)氧1h)：將培養(yǎng)板置于充有99.5%氮?dú)獾娜毖醴跤髦?7℃密閉培養(yǎng)2h，再以95%氧氣+5%二氧化碳進(jìn)行復(fù)氧1h;C組，D組，E組為古拉定處理組，加入古拉定使其終濃度分別為40、80、160mg/L。各組缺氧前、復(fù)氧前均給藥。
1.4實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)(1)計(jì)數(shù)細(xì)胞搏動(dòng)：在倒置顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)心肌細(xì)胞搏動(dòng)的頻率及節(jié)律。(2)細(xì)胞存活率計(jì)數(shù)：采用臺(tái)盼藍(lán)排斥法檢測(cè)，各組取少許細(xì)胞混懸液，0.4%臺(tái)盼藍(lán)混勻2min，按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法在光鏡下計(jì)數(shù)藍(lán)染細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)攝取率=藍(lán)染細(xì)胞/(藍(lán)染細(xì)胞+未藍(lán)染細(xì)胞)×100%。(3)LDH及MDA活性及含量測(cè)定：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后按試劑盒說(shuō)明測(cè)定。
1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)
2結(jié)果
2.1古拉定對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞搏動(dòng)的影響正常培養(yǎng)對(duì)照組心肌細(xì)胞搏動(dòng)相對(duì)恒定，節(jié)律規(guī)則;A/R組心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率減慢，搏動(dòng)幅度減弱，節(jié)律不齊，有部分停搏，與對(duì)照組相比，差異有非常顯著性(P<0.01);各古拉定處理組明顯逆轉(zhuǎn)A/R損傷造成的搏動(dòng)頻率和節(jié)律異常，與A/R組比較差異有顯著性(P<0.05)。
2.2古拉定對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷LDH及MDA的影響結(jié)果表明，A/R心肌損傷是十分明顯的，而古拉定能明顯減輕這種損傷，古拉定處理組各觀察指標(biāo)均差異有顯著性，因此提示古拉定對(duì)于缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞損害具有保護(hù)作用，且存在量效關(guān)系。
3討論
3.1還原型谷胱甘肽對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷的影響大量研究表明，缺血再灌注期間大量氧自由基的產(chǎn)生可造成細(xì)胞損傷。氧自由基導(dǎo)致細(xì)胞損傷主要環(huán)節(jié)為作用于細(xì)胞外基質(zhì)，使膠原和透明質(zhì)酸崩解，使膜磷脂結(jié)構(gòu)的多聚不飽和脂肪酸過(guò)氧化而直接損傷細(xì)胞膜;肌漿網(wǎng)和線粒體崩潰，心肌細(xì)胞在缺氧缺糖條件下，ATP產(chǎn)生減少，代謝障礙，代謝產(chǎn)物堆積，使膜穩(wěn)定性降低，溶酶體釋放，導(dǎo)致生物損傷、變性，使LDH釋放在培養(yǎng)基中，同時(shí)再給氧時(shí)氧自由基增加，細(xì)胞膜受攻擊，細(xì)胞膜損傷。
細(xì)胞內(nèi)LDH進(jìn)一步增加，故LDH釋放量是觀測(cè)缺血再灌注損傷重要指標(biāo)。脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)，其含量變化可作為評(píng)定自由基生成及對(duì)膜脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)破壞的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)從培養(yǎng)的.未成熟鼠心肌細(xì)胞入手，排除了在體和離體灌注模型中神經(jīng)、體液因素及其他混雜細(xì)胞因素的影響，直接利用還原型谷胱甘肽處理培養(yǎng)的未成熟鼠心肌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)還原型谷胱甘肽各濃度組均可降低缺氧/復(fù)氧損傷造成的心肌細(xì)胞死亡率，減少細(xì)胞內(nèi)LDH漏出，減少細(xì)胞內(nèi)MDA生成，且存在量效關(guān)系，表明還原型谷胱甘肽對(duì)未成熟鼠心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。
3.2還原型谷胱甘肽對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制還原型谷胱甘肽(GSH)對(duì)清除自由基有重要作用，它是機(jī)體內(nèi)一種重要的抗氧化劑，它能有效清除氧化產(chǎn)生的自由基，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，并在使暴露于氧化環(huán)境的組織免受自由基損害方面起重要作用。GSH在谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)的作用下對(duì)有機(jī)過(guò)氧化物(ROOH)和無(wú)機(jī)過(guò)氧化物(H2O2)起重要清除作用，其還可以起維生素C還原劑的作用，使維生素C成為還原型而不斷清除超氧自由基。
近期有研究表明，GSH可維持線粒體內(nèi)膜巰基基團(tuán)的還原狀態(tài)。當(dāng)GSH含量下降，內(nèi)源性自由基攻擊線粒體蛋白巰基的可能性增大，一方面使酶活性降低，影響線粒體氧化代謝的3個(gè)關(guān)鍵酶及電子傳遞鏈中酶的活性，NADH減少，ATP產(chǎn)生減少。另一方面，導(dǎo)致膜蛋白巰基氧化交聯(lián)，構(gòu)型改變，線粒體膜滲透性轉(zhuǎn)運(yùn)通道打開(kāi)，鈣釋放增加，胞漿鈣上升，激活細(xì)胞膜PLA2和中性蛋白水解酶(CANP)，導(dǎo)致細(xì)胞膜的損傷或死亡。本實(shí)驗(yàn)表明補(bǔ)充外源性GSH，對(duì)保護(hù)細(xì)胞膜的功能可能具有重要意義，對(duì)臨床各種疾患造成的心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷有保護(hù)作用。
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