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談丹蔞片對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制論文
再灌注治療能快速打開(kāi)堵塞血管、恢復(fù)冠脈血供，是治療冠心病急性心肌梗死的重要手段，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)2013 年冠狀動(dòng)脈經(jīng)皮介入術(shù)( percutaneouscoronary intervention，PCI) 的病例數(shù)超過(guò)40 萬(wàn)例，位居世界第2 位。但再灌注治療只是一種局部治療，并不能終止冠心病的病理發(fā)展進(jìn)程，加之治療后出現(xiàn)的一系列心肌缺血再灌注損傷( myocardialischemia reperfusion injury，MIRI) ，嚴(yán)重制約了冠心病的治療效果。有研究證實(shí)，急性心肌梗死( acutemyocardial infarction，AMI) 患者即使接受最佳的再灌注治療，仍有10% ～ 30%出現(xiàn)MIRI，MIRI 被認(rèn)為是導(dǎo)致心梗后心力衰竭發(fā)生率高達(dá)25% 及年死亡率達(dá)10% 的主要原因，因此防治MIRI 是臨床亟需解決的問(wèn)題。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮功能障礙、脂質(zhì)氧化損傷、炎癥反應(yīng)、鈣超載及能量代謝等在MIRI的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
MIRI 目前臨床尚缺乏有效的干預(yù)藥物，中醫(yī)藥具有作用通路廣泛、作用靶點(diǎn)多樣的特點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中具有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)。丹蔞片是痰瘀同治的上市藥物，臨床用于治療各類(lèi)冠心病心絞痛，臨床療效良好，目前關(guān)于丹蔞片的實(shí)驗(yàn)研究大都針對(duì)心肌梗死后對(duì)心臟的保護(hù)作用，而對(duì)MIRI 后心臟保護(hù)作用的研究鮮有報(bào)道。課題組前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，丹蔞片能降低大鼠心肌缺血程度，增加離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道相關(guān)酶活性，減少短暫心肌缺血再灌注誘導(dǎo)的致命性及非致命性室顫發(fā)生率、室性心動(dòng)過(guò)速及室性早搏的發(fā)生頻率及持續(xù)時(shí)間。在此基礎(chǔ)上，為闡明丹蔞片對(duì)已有心肌不可逆壞死的心肌缺血再灌注治療后的心臟保護(hù)作用，本研究觀察其對(duì)大鼠心肌壞死程度及心臟射血分?jǐn)?shù)的影響，并從內(nèi)皮功能保護(hù)、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化及細(xì)胞凋亡方面探討其作用機(jī)制，為擴(kuò)大丹蔞片的臨床應(yīng)用范圍提供數(shù)據(jù)支撐。
1 材料
1. 1 動(dòng)物清潔級(jí)雄性健康Wistar 大鼠80 只，體重( 300 ± 20) g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK( 京) 2012-0001，在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院動(dòng)物中心適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。
1. 2 藥品及試劑丹蔞片( 吉林康乃爾藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20050244) ; 羧甲基纖維素鈉，2，3，5-氯化三苯基四氮唑( TTC) ，伊文思藍(lán)，水合氯醛( 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)分別為20081023，20140507，20140228，20130201) ; 乳酸脫氫酶( LDH) 試劑盒，肌酸激酶同工酶( CK-MB) 試劑盒( 貝克曼庫(kù)爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司，批號(hào)分別為AUZ1443，OSR61155) ; 大鼠內(nèi)皮素( ET) 試劑盒( 北京北方生物技術(shù)研究所，批號(hào)S20083014) ; 大鼠一氧化氮( NO) ，丙二醛( MDA) 及髓過(guò)氧化物酶( MPO) 試劑盒( 南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為A012，A003-1，A044 ) ; Protease inhibitorcocktail( Roche 公司，批號(hào)11684817910) ; 蛋白免疫印跡法( Western blot) 抗體含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶( Caspase) -3，B 細(xì)胞淋巴瘤-2( Bcl-2) 及Bcl-2相關(guān)X 蛋白( Bax) ( CST 公司，批號(hào)分別為12768，2772， 2870) ; β-肌動(dòng)蛋白( β-actin) 抗體( 中杉金橋公司，批號(hào)TA-09 ) ; DNA 斷裂的原位末端標(biāo)記法( TUNEL) 反應(yīng)液( Roche 公司，貨號(hào)11684817910) 。
1. 3 主要儀器RM6240BD 型多通道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)，HX-300 型小動(dòng)物呼吸機(jī)( 成都泰萌科技有限公司) ; Pro Sound 5000 SSD-SV B 型超聲儀( 日本Aloka 株式會(huì)社ALOKA 醫(yī)用儀器有限公司) ; AU640 型全自動(dòng)生化分析儀( 美國(guó)Olympus 公司) ; Image Pro Plus 6. 0 圖像分析系統(tǒng)軟件( 美國(guó)Media Cybernetics 公司) ; UV-2000 型紫外分光光度計(jì)( 上海尤尼柯公司) ; TGL-16 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)( 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司) ; SPR-960 型全自動(dòng)酶標(biāo)儀( 美國(guó)Thermo 科技公司) ; VE186 型小型高通量垂直電泳槽VE180 及轉(zhuǎn)移電泳槽( 上海天能公司) 。
2 方法
2. 1 分組及給藥大鼠按體重隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、丹蔞片組，假手術(shù)組22 只，模型組30 只，丹蔞片組28 只，預(yù)防性給藥7 d，然后進(jìn)行造模手術(shù)。其中假手術(shù)及模型組均以0. 5%的羧甲基纖維素鈉灌胃，根據(jù)文獻(xiàn)丹蔞片給藥劑量選擇0. 9 g·kg - 1，丹蔞片研碎后溶于0. 5%羧甲基纖維素鈉制成混懸液，灌胃體積為10 mL·kg - 1。
2. 2 模型建立以10% 水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)口腔行氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，呼吸頻率約70 次/min，潮氣量7 ～ 8 mL，呼吸比1 ∶ 3，連接多通道生理信號(hào)采集系統(tǒng)，描記術(shù)前Ⅱ?qū)?lián)心電圖。于左側(cè)第3 或第3 肋間切口，鈍性分離皮下組織及肌肉，打開(kāi)心包膜，在左心耳下緣距肺動(dòng)脈弓根部2 mm處結(jié)扎( 3 /8 圓針) ，進(jìn)針深度約1 mm，寬度約2 mm，在冠脈前降支面置硅膠管連同冠脈用4 號(hào)醫(yī)用縫合線一起結(jié)扎。50 min 后，剪去結(jié)扎線，連同硅膠管一同取出，進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組只在相應(yīng)部位穿線不結(jié)扎。關(guān)閉胸腔，逐層縫合肌肉、皮膚，術(shù)后腹腔注射青霉素10 萬(wàn)單位預(yù)防感染。結(jié)扎成功標(biāo)志: 結(jié)扎下方心肌顏色變灰白，同時(shí)心電圖ST 段進(jìn)行性抬高甚至弓背向上( 較正常至少抬高2 mm) 。復(fù)灌成功標(biāo)志: 心臟顏色由灰白逐漸恢復(fù)正常，或30 min 內(nèi)心電圖ST 下降至少50%。造模前心率<350 次/min 者，未到規(guī)定時(shí)間死亡者及造模不成功者予以剔除。
2. 3 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè)
2. 3. 1 再灌注2 h 心肌酶、內(nèi)皮功能檢測(cè)每組取6 只大鼠，采集血清，以全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)LDH及CK-MB，以放射免疫法檢測(cè)血清ET-1，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)血清NO 水平，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)心肌MDA，MPO 水平。
2. 3. 2 心肌梗死面積測(cè)定未取血大鼠于再灌注48 h 時(shí)處死，術(shù)前與取材前B 超檢測(cè)心臟射血分?jǐn)?shù)，從大鼠左肺靜脈注射0. 5%依文思藍(lán)約1. 5 mL，待大鼠口唇爪甲變藍(lán)后摘取心臟，以冰鹽水沖洗，擦干，置于- 20 ℃凍存20 min 后，沿結(jié)扎線以下切成等厚的4 ～ 5 片，放入1% TTC 溶液中，37 ℃ 孵育15 ～ 20 min，流水沖洗。非缺血區(qū)呈藍(lán)色，缺血未梗死區(qū)呈磚紅色，缺血區(qū)( area at risk，AAR) 為灰白區(qū)與磚紅色區(qū)域之和，梗死區(qū)( area of necrosis，AN) 呈灰白色，放置于10%甲醛中室溫固定24 h。然后用L2035AW Pioneer 數(shù)碼照相機(jī)進(jìn)行圖像采集，以Version 6. 0 Media Cybernetics Image-Pro Plus 圖像分析軟件分別計(jì)算出梗死區(qū)、占缺血區(qū)面積的比例，缺血區(qū)占左室面積的比例。
2. 3. 3 Western blot 法檢測(cè)心肌Caspase-3，Bax 及Bcl-2 蛋白表達(dá)每組取6 只大鼠分別檢測(cè)心肌Caspase-3，Bax 及Bcl-2 蛋白表達(dá)。根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)提取蛋白，BCA 法檢測(cè)組織蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度，上樣，根據(jù)蛋白目的分子量設(shè)定電泳條件，轉(zhuǎn)膜，封閉，經(jīng)一抗( 1 ∶ 1 000) ，二抗孵育，顯色曝光，將顯色后的圖片掃描后，使用Gel Image system ver. 4. 00軟件( 上海天能科技有限公司) 對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。以目的蛋白灰度值/β-actin 灰度值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。
2. 3. 4 TUNEL 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡每組取6 只大鼠做心臟石蠟切片，脫水，蛋白酶K 中孵育后避光條件下加稀釋液，TUNEL 反應(yīng)液，37 ℃放置1 h 轉(zhuǎn)化converter-POD( POD) ，37 ℃ 烤箱中放置30 min，取出沖洗后加DAB，經(jīng)蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯溶液透明，封片。于光學(xué)顯微鏡下觀察，其中正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)出深淺不一的棕褐色。每張切片于凋亡細(xì)胞分布相同區(qū)域隨機(jī)選取5 個(gè)高倍視野，計(jì)算平均每個(gè)視野中的凋亡細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比，即為凋亡指數(shù)。
2. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用SPSS 17. 0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料結(jié)果以珋x ± s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，P < 0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3 結(jié)果
3. 1 丹蔞片對(duì)再灌注2 h 心肌酶的影響與假手術(shù)比較，模型組及丹蔞片組LDH 及CK-MB 均顯著升高( P < 0. 01) ; 與模型組比較，丹蔞片組LDH 及CK-MB 均明顯降低( P < 0. 05) 。
3. 2 丹蔞片對(duì)再灌注2 h 內(nèi)皮功能的影響與假手術(shù)比較，模型組血清ET-1 顯著上升( P < 0. 01) ，NO 明顯下降( P < 0. 05) ; 與模型比較，丹蔞片組ET-1 明顯下降( P < 0. 05) ，而NO 明顯上升( P<0. 05) 。
3. 3 丹蔞片對(duì)再灌注2 h 心肌組織氧化損傷的影響與假手術(shù)組比較，模型組MDA 及MPO 均顯著升高( P < 0. 01) ; 與模型組比較，丹蔞片組MDA 及MPO 明顯降低( P < 0. 05) 。
3. 4 丹蔞片對(duì)再灌注48 h 心臟射血分?jǐn)?shù)及心肌梗死面積的影響與假手術(shù)組比較，模型組及丹蔞片組大鼠EF 值顯著下降( P < 0. 01) ; 與模型組比較，丹蔞片組大鼠EF 值明顯上升( P < 0. 05) 。假手術(shù)組無(wú)心肌梗死; 與模型組比較，丹蔞片組心梗/缺血面積比率顯著下降( P < 0. 01) 。
3. 5 丹蔞片對(duì)再灌注48 h 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)影響與假手術(shù)比較，各組心肌凋亡指數(shù)均有顯著升高( P < 0. 01) ; 與模型組比較，丹蔞片能顯著降低心肌凋亡指數(shù)( P < 0. 01) 。
3. 6 丹蔞片對(duì)再灌注48 h 心肌Caspase-3，Bax 及Bcl-2 的蛋白表達(dá)的影響與假手術(shù)比較，模型組及丹蔞片組Caspase-3 表達(dá)明顯升高( P < 0. 05，P<0. 01) ; 與模型比較，丹蔞片組Caspase-3 表達(dá)顯著降低( P < 0. 01) 。與假手術(shù)比較，模型組及丹蔞片組Bax 表達(dá)明顯升高( P < 0. 05，P < 0. 01) ; 與模型比較，丹蔞片組Bax 表達(dá)顯著降低( P < 0. 01) 。與假手術(shù)比較，模型組及丹蔞片組Bcl-2 表達(dá)顯著降低4 討論MIRI 在臨床可表現(xiàn)為再灌注心律失常，心肌無(wú)復(fù)流現(xiàn)象及心肌頓抑等，此類(lèi)患者預(yù)后不良，心力衰竭、心源性猝死等發(fā)生機(jī)率較高。其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，至今還未完全明確，綜合以前研究結(jié)果認(rèn)為，氧自由基損傷、炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮功能障礙、鈣超載等在MIRI 過(guò)程中相互影響，對(duì)心肌造成巨大損害。其中內(nèi)皮功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)環(huán)節(jié)，更是貫穿心肌缺血及再灌注損傷的全過(guò)程。內(nèi)皮損傷后其分泌功能障礙，擴(kuò)血管物質(zhì)NO 減少，破壞了與縮血管物質(zhì)ET 間的動(dòng)態(tài)平衡，一方面內(nèi)皮損傷促進(jìn)血管收縮心肌缺血進(jìn)一步加重; 另一方面造成內(nèi)皮細(xì)胞的屏障作用破壞，為中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞及炎性細(xì)胞物質(zhì)的浸潤(rùn)提供了場(chǎng)所，間接加重炎癥反應(yīng)。此外MIRI 發(fā)生時(shí)，缺血區(qū)心肌神經(jīng)末梢釋放大量?jī)翰璺影�，被單胺氧化酶分解后產(chǎn)生大量氧自由基( OFR) ，超過(guò)機(jī)體的清除能力，引發(fā)鏈?zhǔn)街|(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，損傷細(xì)胞膜、細(xì)胞器乃至細(xì)胞內(nèi)核酸，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡甚至壞死，OFR對(duì)組織的損傷要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于缺血本身造成的損傷。心肌細(xì)胞凋亡是MIRI 的最終環(huán)節(jié)，心肌缺血20 ～30 min 即可發(fā)生壞死并且具有不可再生的特性，故壞死周?chē)臑l死心肌是臨床治療上爭(zhēng)取的對(duì)象，阻止壞死周邊心肌細(xì)胞凋亡成為治療MIRI 的關(guān)鍵病理基礎(chǔ)，文中提到的氧自由基、炎癥因子、鈣超載等共同對(duì)心肌細(xì)胞造成損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Bax 和Bcl-2 是一對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的基因，Bax 促進(jìn)細(xì)胞凋亡而B(niǎo)cl-2 可抑制細(xì)胞凋亡，激活下一級(jí)Caspases酶系引起細(xì)胞的凋亡。其中Caspase-3 是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者，活化后可分解細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白及底物，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
本研究發(fā)現(xiàn)，丹蔞片在再灌注損傷發(fā)生的早期能促進(jìn)MIRI 后內(nèi)皮細(xì)胞NO 的釋放，抑制縮血管物質(zhì)的釋放，修復(fù)受損的內(nèi)皮分泌功能。MDA 反應(yīng)體內(nèi)自由基的多少，MPO 反應(yīng)體內(nèi)中性粒細(xì)胞的活動(dòng)程度，丹蔞片能抑制心肌組織中MDA 及MPO 生成，改善自由基及炎癥細(xì)胞對(duì)心肌的損傷。此外，丹蔞片在減少心肌梗死面積的同時(shí)還能有效阻止MIRI后心臟射血分?jǐn)?shù)的下降趨勢(shì)。有臨床研究證實(shí)，低EF 值冠心病患者在冠脈旁路移植術(shù)前，應(yīng)用主動(dòng)脈內(nèi)球囊反搏術(shù)可改善心功能后，能減少術(shù)后心梗、低心排血量等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生并能降低圍術(shù)期病死率。另對(duì)擇期PCI 的患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞計(jì)數(shù)，C 反應(yīng)蛋白( CRP) 升高與EF 值降低有關(guān)，提示丹蔞片改善心臟EF 值可能與降低炎癥反應(yīng)的作用有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，丹蔞片可抑制心肌促凋亡蛋白Bax，Caspases-3 的表達(dá)，提高抑制凋亡基因蛋白Bcl-2 的表達(dá)，丹蔞片可能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡保護(hù)梗死區(qū)周?chē)男募�，從而降低心肌梗死區(qū)與缺血區(qū)比例，保護(hù)再灌注損傷的心臟�，F(xiàn)代藥理研究表明，丹蔞片成分中黃芪、丹參、葛根、川芎等諸多藥物提取物均有廣泛的心血管效應(yīng)，采用生物信息學(xué)方法推測(cè)它們可能通過(guò)環(huán)加氧酶2，瘦素蛋白，一氧化氮合酶3 及低密度脂蛋白受體起作用，但尚缺乏相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，這些已知化學(xué)成分協(xié)同作用于心血管系統(tǒng)，從多途徑、多靶點(diǎn)發(fā)揮MIRI 后對(duì)心臟的保護(hù)作用。
丹蔞片具有活血化痰、寬胸通陽(yáng)之效，在臨床應(yīng)用中對(duì)穩(wěn)定型心絞痛、支架植入術(shù)后患者及非血運(yùn)重建急性冠脈綜合征患者均有確切的療效，亦有臨床研究表明丹蔞片具有一定的降血脂和穩(wěn)定斑塊作用，加之其降血壓和減慢心率的作用共同組成緩解臨床癥狀的基礎(chǔ)。MIRI 是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，心肌細(xì)胞壞死及凋亡是心肌組織學(xué)損害的最終結(jié)果，該過(guò)程有大量信號(hào)通路參與，損害通路和救助通路交織成網(wǎng)狀。本實(shí)驗(yàn)探索了丹蔞片治療MIRI 機(jī)制，至于其對(duì)信號(hào)通路及其相關(guān)調(diào)控蛋白基因的影響有待于進(jìn)一步研究，明確其作用機(jī)制，為丹蔞片防治MIRI 提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)支撐。
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