生物材料中分離純化淀粉酶教案設(shè)計(jì)
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一、目的和要求
1.掌握鹽析法初步分離純化蛋白質(zhì)的原理和方法；
2.掌握透析脫鹽濃縮蛋白質(zhì)的原理和方法。
3.掌握膜分離原理和方法
二、基本原理
1.蛋白質(zhì)的鹽析
蛋白質(zhì)是親水膠體，借水化膜和同性電荷（在PH值7.0的溶液中一般蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷）維持膠體的穩(wěn)定性。由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間電荷的極性基團(tuán)有著靜電引力，當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入少量堿金屬或堿土金屬的中性鹽類(lèi)[如(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl或MgSO4等]時(shí)，由于鹽類(lèi)離子與水分子對(duì)蛋白質(zhì)分子上的極性基團(tuán)的影響，使蛋白質(zhì)在水中溶解度增大，因此蛋白質(zhì)、酶等在低鹽濃度下的溶解質(zhì)隨著鹽液濃度升高而增加，此時(shí)稱(chēng)為鹽溶；當(dāng)鹽濃度不斷上升并達(dá)到一定濃度時(shí)，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，水化膜被破壞，于是蛋白質(zhì)就相互聚集而沉淀析出，蛋白質(zhì)和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，稱(chēng)為蛋白質(zhì)的鹽析。
由鹽析所得的蛋白質(zhì)沉淀，經(jīng)過(guò)透析或用水稀釋以減低或除去鹽后，能再溶解并恢復(fù)其分子原有結(jié)構(gòu)及生物活性，因此由鹽析生成的沉淀是可逆性沉淀。鹽析法就根據(jù)不同蛋白質(zhì)和酶在一定濃度的鹽溶液中溶解度降低程度的不同而達(dá)到彼此分離的方法。鹽析法對(duì)于許多非電解質(zhì)的`分離純化都是適合的，也是蛋白質(zhì)和酶提純工作應(yīng)用最早，至今仍廣泛使用的方法。
2.透析脫鹽的原理
蛋白質(zhì)的分子很大，其顆粒在膠體顆粒范圍（直徑1～100nm）內(nèi)，不能透過(guò)半透膜。選用孔徑合宜的半透膜，使小分子物質(zhì)能夠透過(guò)，而蛋白質(zhì)顆粒不能透過(guò)，這樣就可使蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)分開(kāi)。把蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋中，袋的兩端用線扎緊，然后用蒸餾水或緩沖液進(jìn)行透析，這時(shí)鹽離子通過(guò)透析袋擴(kuò)散到水或緩沖液中，蛋白質(zhì)分子量大不能穿透析袋而保留在袋內(nèi)，通過(guò)不斷更換蒸餾水或緩沖液，直至袋內(nèi)鹽分透析完畢。這種方法可除去和蛋白質(zhì)混合的中性鹽及其他小分子物質(zhì)，是常用來(lái)純化蛋白質(zhì)的方法。透析需要較長(zhǎng)時(shí)間，常在低溫下進(jìn)行，并加入防腐劑避免蛋白質(zhì)和酶的變性或微生物的污染。
三、試驗(yàn)材料
1.培養(yǎng)基
種子培養(yǎng)基：牛肉膏5g 蛋白胨10g NaCl 5g 可溶性淀粉 2g 葡萄糖1.5g /1000ml H2O 配100ml
發(fā)酵培養(yǎng)基：牛肉膏5g 蛋白胨10g NaCl 5g可溶性淀粉 2g /1000ml
2.酶活測(cè)定溶液
0.2mol/LpH6.8 PBS緩沖液 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液1mg/mL DNS試劑（3,5-二硝基水楊酸試劑）
3.試劑
蛋白胨、牛肉膏、可溶性淀粉、(NH4)2SO4、NaOH、HCl、、Na2HPO412H2O、NaH2PO4H2O、EDTA
4.儀器或其它用具
微量移液器、移液器槍頭、透析袋、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、紫外檢測(cè)儀（分光光度計(jì)）、離心機(jī)、分析天平、pH計(jì)、量筒、250ml瓶、分裝架、記號(hào)筆、紗布、酒精燈、滅菌鍋、干燥箱、恒溫水浴鍋等；
四、試驗(yàn)路線
發(fā)酵培養(yǎng)→粗酶液制備→硫酸銨鹽析→透析脫鹽濃縮→濃縮酶液酶活測(cè)定
五、操作步驟
1.菌株發(fā)酵
將實(shí)驗(yàn)一中純化的菌株接入種子培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)24h，2% 的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，37℃，180r/min，培養(yǎng)36h；
2.粗酶液的制備
發(fā)酵液在8000r/min離心20min，收集上清液即為粗酶液，測(cè)定酶活方法參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)三DNS測(cè)淀粉酶活力。
3.硫酸銨鹽析
3.1 鹽析條件的確定
40%、60%和80%
鹽析步驟
1）發(fā)酵液上清分裝至3支燒杯中，每個(gè)20ml；
2）加硫酸銨至3支燒杯中，對(duì)照25℃硫酸銨飽和度配置表，使其飽和度分別為40%、60%和80%。在加硫酸銨時(shí)需緩慢的加入，同時(shí)不斷的輕柔攪拌（否則局部濃度過(guò)高會(huì)使酶失活）使硫酸銨完全溶解；
3）室溫靜置2h，出現(xiàn)白色沉淀
4）離心，分別取沉淀用少量0.2mol/LpH6.8 PBS緩沖液回溶。
4.透析脫鹽濃縮
4.1 透析膜前處理
透析袋的預(yù)處理方法：
1）將透析袋剪成合適的長(zhǎng)度；
2）在一只250 mL的玻璃燒杯中，加入200 mL的透析袋處理液，微波爐中預(yù)熱；
3）將透析袋裝入其中，電爐上煮沸10 min；
4）用蒸餾水徹底洗滌；
5）蒸餾水中煮10 min；
6）冷卻后4℃存放，存放過(guò)程中透析袋應(yīng)完全放入0.02mol/L磷酸酸緩沖液（pH7.0）中
7 用細(xì)線扎緊透析袋一端，注入清水檢驗(yàn)不漏后加入不超過(guò)透析袋體積1/2的須透析溶液。
4.2 操作
1 沉淀用少量0.2mol/LpH6.8 PBS緩沖液回溶，移入透析袋中，經(jīng)透析膜袋在20倍量0.02mol/L磷酸緩沖液（pH7.0）中在室溫，36h透析脫鹽（每過(guò)6h換一次透析液).
2 取各梯度脫鹽沉淀5ml 8000r/min離心20min，取上清測(cè)酶活。（沉淀為變性蛋白質(zhì)酶活很低。）
5.酶活力的測(cè)定
參照實(shí)驗(yàn)三中的酶活測(cè)定。
六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
粗酶液 540nm 0.291 0.314
鹽析40%60% 80%
1.221 2.708 1.456
七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告
1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
�。�1）測(cè)定粗酶液酶活；
粗酶液 540nm 0.291 0.314 （取平均值)
酶活力9.705
�。�2）測(cè)定透析后酶液的酶活力
40%60% 80%
540nm吸光度 1.221 2.708 1.456
酶活力36.63 81.24 43.68
2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析
通過(guò)比較可知 在硫酸銨飽和度為 60%時(shí)分離純化淀粉酶酶活力最高。經(jīng)鹽析，透析除鹽后酶活力大大提高純化后的酶活力約為粗酶活力的4~9倍。
八、注意事項(xiàng)
�。�1）硫酸銨飽和度計(jì)算及加入方式：在分段鹽析時(shí)，加鹽濃度一般以飽和度表示，所需達(dá)到飽和度較高而溶液的體積又不再過(guò)分增大時(shí)，可直接加固體硫酸銨，其加入量見(jiàn)附表。注意看清是25℃硫酸銨飽和度表
�。�2）清洗透析袋內(nèi)外時(shí)，操作過(guò)程中應(yīng)使用鑷子或戴手套；
�。�3）蛋白質(zhì)溶液用透析法去鹽時(shí)，正負(fù)離子透過(guò)半透膜的速度不同。以硫酸銨為例，NH4＋的透出較快.在透析過(guò)程中膜內(nèi)SO42-剩余而生成H2SO4，而使膜內(nèi)蛋白質(zhì)溶液呈酸性，足以達(dá)到使蛋白質(zhì)變性的酸度，因此在用鹽析法純化蛋白質(zhì)做透析去鹽時(shí)，開(kāi)始應(yīng)用0.1M的NH4OH透析，或者用緩沖液配制蛋白溶液。
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