PCR自我鑒定
篇一：PCR個人經(jīng)驗總結
PCR經(jīng)驗總結
1. primers design
這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些條件
a 足夠長,18-24bp,以保證特異性.當然不是說越長越好,太長的引物同樣會降低特異性,并且降低產(chǎn)量。
b GC% 40%-60%
c 5'端和中間序列要多GC,以增加穩(wěn)定性
d 避免3'端GC rich, 最后3個BASE不要有GC,或者最后5個有3個不要是GC e. 避免3'端的互補, 否則容易造成DIMER
f. 避免3'端的錯配
g. 避免內部形成二級結構
h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值時不需要加上這些序列,但在檢測互補 和二級結構是要加上它們
i. 需要使用兼并引物時, 要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用較高的引物濃度(1uM-3uM)
j. 最好學會使用一種design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.
* 引物的另一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的 Tm低5℃。
設定Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的引物。有的是根據(jù)GC含量估算Tm。確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結構和相鄰堿基的特性預測引物的雜交穩(wěn)定性。大部分計算機程序使用近鄰分析法。 根據(jù)所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點�？梢酝ㄟ^分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。
為獲得最佳結果，兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會引物在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設定為比最低的Tm低5℃或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設計的退火溫度先進行5個循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設計的退火溫度進行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
2. stability of primers
定制引物的標準純度對于大多數(shù)PCR應用是足夠的。引物產(chǎn)量受合成化學的效率及純化方法的影響。定制引物以干粉形式運輸。最好在TE重溶引物，使其最終濃度為100μM。TE比去離子水好，因為水的pH經(jīng)常偏酸，會引起寡核苷的水解。引物的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應將干粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的引物在 -20℃可以穩(wěn)定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存 2個月。
3. optimize reactants concentration
a. magnesiom ions
Mg離子的作用主要是 dNTP-Mg 與核酸骨架相互作用，并能影響Polymerase的活性。
一般 的情況下 Mg的濃度在0.5-5mM之間調整。同樣要記住的是在調整了dNTPs的濃度后要相應的調整Mg離子的濃度。對實時定量PCR，使用3-5mM帶有熒光探針的鎂離子溶液。
b. 其他的離子
NH4+ K+都會影響PCR。增加K+的濃度后, 會因為中和了核酸骨架上磷酸基團的負電荷而影響退火的溫度,從而降低了PCR的 嚴謹性(stringency).NH4+也有相同的作用. MBI公司的TAQ酶就提供了兩種BUFFER, 一種是加Mg的一種是已經(jīng)混合了(NH4)2SO4的.當然, 過高的陽離子濃度(KCL>0.2M)時, DNA在94度根本不會發(fā)生變性, 當然也就無從談起PCR了.
c. polymerase
不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握適合的酶的濃度。一些高保真酶的效率要遠遠低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的 情況下, 變性的溫度可以使用90~92度, 變性的時間也可以縮短,從而保證polymerase的活性 d. template
50ul PCR SYSTEM
human gDNA 0.1ug-1ug
E.Coli 10ng-100ng
Lamada DNA 0.5ng-5ng Plasmid DNA 0.1ng-10ng
4. temperature
a. denaturation
常規(guī)是94度5分鐘, GC Rich的摸板是95度5分鐘，除了GC Rich外, 常規(guī)的APPLICATIONS可以將這部分時間縮短到1到2分鐘, 或者在CYCLE 1時給予較長的時間,而取消開始的denaturation
b. annealing
重點到了。一般情況下, 是從55度開始.根據(jù)情況配合以Mg離子濃度進行調整. 有條件的可以做gradient pcr. 退火的時間在30-60S, 時間短一些可以得到更好的效果. 因為, polymerase 在annealing temp.時也會有一些活性. 所以在A.T.的時間過長, 會極大的增加非特異性擴增的風險.另外,在對于一些困難戶, 比如從gDNA里擴增大片段, 還可使用two step PCR.
5. touchdown PCR
原理很簡單,但的確是一個很有用的方法。舉個例子就OK, ANNEALING TEMP. 55度 94 5min—（94 30s—60 30s—72 1min）×2—（94 30s—59 30s—72 1min ）×2—（94 30s—58 30s—72 1min）×2—........—（94 30s—51 30s—72 1min）×2—（94 30s—50 30s—72 1min）×20—72 5min
6. hot start PCR
熱啟動PCR是除了好的引物設計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一。盡管Taq DNA聚合酶的最佳延伸溫度在72℃，聚合酶在室溫仍然有活性。因此，在進行PCR反應配制過程中，以及在熱循環(huán)剛開始，保溫溫度低于退火溫度時會產(chǎn)生非特異性的產(chǎn)物。這些非特異性產(chǎn)物一旦形成，就會被有效擴增。在用于引物設計的位點因為遺傳元件的定位而受限時，如site-directed突變、表達克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構建和操作，熱啟動PCR尤為有效。 限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應液，并
將其置于預熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特異性產(chǎn)物的擴增。
熱啟動通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR儀達到變性溫度。包括延緩加入Taq DNA聚合酶，在反應體系達到90度時，PAUSE，將溫度保持在70度以上，手工加入polymerase，但這個方法 過于煩瑣，尤其是對高通量應用，并容易造成污染。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本成分，加入鎂離子或酶，包裹起來，或者將反應成分，如模板和緩沖液，物理地隔離開。在熱循環(huán)時，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。有很多公司提供這樣的酶。
ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer)
Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega)
Magnesium wax beads (Stratagene).
象手動熱啟動方法一樣，蠟防護層法比較煩瑣，易于污染，不適用于于高通量應用。還有一種方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗體抑制失活，當變性溫度超過70度時，抗體也變性了，這樣polymerase又被激活了。
7. Booster PCR
我們知道1ug human genomic DNA 大約在3X105個模板分子,這樣的模板分子數(shù)目可以是引物與模板很好的結合. 當模板的濃度過低,比如低于100個分子時, 引物和模板之間就很難發(fā)生反應. 引物容易自身進行反應形成二聚體.這樣就有來了個 booster PCR 我一直找不到合適的詞來翻譯這個booster.具體是這樣的.開始幾個cycles保持primer的低濃度,保證primer:template的 molar ratio在107~ 108. 以確保開始擴增的準確性.然后booste Primer的濃度到正常的水平
8. 循環(huán)數(shù)和長度
確定循環(huán)數(shù)的基本原理是: 產(chǎn)物能夠保證你進一步分析操作的最小循環(huán)數(shù).因為過多的循環(huán)數(shù)容易造 成ERRORS和非特異性產(chǎn)物的`積累、產(chǎn)物的量不夠, 優(yōu)化的方法有:
1. 增加TEMPLATE
2. 增加循環(huán)數(shù)
如何確定循環(huán)數(shù),有一個方法.做一個PCR體系,40循環(huán),50ul, 分別在20,25,30,35循環(huán)時從體系中取5ul,一起跑電泳分析.從而確定最佳的循環(huán)數(shù)另一個會影響PCR特異性的是PCR cycling時在兩個溫度間變化的速率(ramping rate).當然是越高越好.不過咱們大部分條件有限,就那么幾臺PCR儀,也沒有多少挑選的余地
9. thermal cycler
PCR儀的因素我們經(jīng)常容易忽視.長時間的使用后需要調整PCR儀,以保證其能夠到達正確的溫度.現(xiàn)在的PCR儀基本上都有自檢功能(self-diagnosis).
10. PCR additives
附加物或者說enhancer實在是多種多樣. 基本上包括幾類, 能夠增加反應退火效率的化學因子, DNA結合蛋白和一些商業(yè)試劑. 基本的原理不外是增加引物退火特異性,減少錯配, 增加產(chǎn)物的長度和產(chǎn)量.在GC Rich情況中, additive可以造成配對堿基間的的不穩(wěn)定,從而提高擴增的效率.而在另一種情況下,additive由于造成錯配的primer-template 復合物的極大的不穩(wěn)定, 而提高了擴增的忠實性.要注意的是,沒有萬能的enhancer全部通用,需要你根據(jù)自己的情況,最好結合gradient pcr選擇最優(yōu)條件.
====================================================
dimethyl sulfoxide(DMSO) up to 10%
formamide at 5%
trimethylammonium chloride 10-100uM
detergents such as Tween 20 0.1-2.5%
polyethylene glycol (PEG)6000 5-15%
glycerol 10-15%
single stranded DNA binding proteins
Gene 32 protein 1nM
E.coli single-stranded DNA binding protein 5uM
7 deaza-dGTP(for GC rich) 150uM with 50uM dGTP
Taq Extehder (stratagene)
Perfect Match PCR Enhancer(stratagene)
Q-solution(Qiagen)
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要注意的是,DMSO,GLYCEROL等會抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最適的濃度
11. Template DNA preparation
提取DNA時的試劑會抑制PCR反應的順利進行.因此需要對TEMPLATE DNA進行純化.特別是SDS(<0.01%) 的情況下就能強烈抑制PCR的進行. 可以加入一些nonionic試劑,如Tween, Nonid, Trition之類的反過來抑制SDS. 還有proteinase K也要除干凈, 不然會降解polymerase.
12. Nested PCR
簡單點說 設計兩對引物, 一對是長的, 一對是包含在長引物內的, 用長引物擴增的產(chǎn)物作為第二次擴增的模板,這樣可以增加產(chǎn)物的量. 而且可以減少非特異性帶和錯配的情況. 增加PCR的保真性
高保真酶
高溫DNA POLYMERASE是以單鏈DNA或RNA為模板，在dNTP和一些陽離子的存在情況下，在特定的引物指導下按3'-5'方向合成DNA.包括3種類型：
a.5'-3'方向的DNA合成能力,沒有3'-5'方向的外切酶特性.如Taq及其突變體.這類酶的合成能力強,因為他不糾正合成中出現(xiàn)的突變
b.與a類似,有合成活性,沒有3-5的外切活性.但他們能以RNA為模板,合成DNA. 如Tth DNA Polymerase
c.有DNA聚合活性,沒有逆轉錄活性,但有3-5方向的外切酶活性.如pfu DNA Polymerase.可以提高忠實性。但是這些聚合酶的產(chǎn)量比Taq DNA聚合酶低。 酶的混合物
將Taq DNA聚合酶同帶有3'到5'外切核酸酶活性第二種聚合酶混合在一起可以獲得比單獨Taq DNA聚合酶高的忠實性，并可以得到高產(chǎn)量及擴增長模板。
其他因素
除了酶，高濃度的dNTP或鎂離子會降低忠實性。將dNTP的濃度從200μM降低到25-50μM可以增加精確度如果四種核苷的濃度不同，忠實性會受影響。進行較少的PCR循環(huán)也會有助于增加忠實性，因為增加循環(huán)數(shù)目和產(chǎn)物長度就會增加突變可能性。
篇二：醫(yī)學檢驗自我鑒定范文
醫(yī)學檢驗自我鑒定范文
英語水平：具有一定的英語聽說讀寫能力
計算機水平：國家計算機一級
普通話水平：國家二級
學習經(jīng)歷：xx年8月至xx年7月 尉氏三中
xx年9月至xx年7月 山東聊城職業(yè)技術學院
實習經(jīng)歷：xx年8月至xx年1月在開封市第一人民醫(yī)院檢驗科，輸血科實習
xx年2月至今在開封市淮河醫(yī)院檢驗科實習
興趣特長：對專業(yè)理論知識掌握牢固并能熟練應用，對臨檢室，生化室，免疫室，細胞室等操作熟練。
擅長乒乓球，喜歡舞蹈，音樂
自我評價：極有耐心，為人誠懇，樂于助人，積極向上，有較強的團隊意識和學習能力，業(yè)務知識熟練，社會適應能力強，多才多藝
求職意向：與檢驗相關職業(yè)
醫(yī)學檢驗個人自我鑒定范文(三)
本人在校期間認真完成了本科階段的專業(yè)知識，涉獵了許多醫(yī)學書刊及文獻，熟練的掌握了基礎理論知識及操作技術，有很強的責任心和敬業(yè)精神，專業(yè)知識過硬，有旺盛的求知欲，廣泛愛好，時間觀念強;嚴于自律，吃苦耐勞;團隊親和力強，有較強的環(huán)境適應能力。 具有兩年實習經(jīng)歷的我積累了很多的臨床經(jīng)驗，熟悉和掌握了各科常見疾病的診療常規(guī)及治療原則，能夠正規(guī)全面系統(tǒng)的進行體格檢查、及時完成醫(yī)療文件書寫，了解常用藥物的劑量及用法;多次參加危重癥患者的搶救，進行了專業(yè)的“三基”培訓，實習期間可獨立完成檢驗任務，能夠與帶教老師達成共識，得到了醫(yī)院領導及老師的肯定�？墒炀毻瓿膳R床檢驗的基本操作等。所以我希望找一份與自身知識結構相關的工作，如醫(yī)學檢驗技術可以有更大的空間來證明自己，發(fā)展自己!
醫(yī)學檢驗專業(yè)個人簡歷自我鑒定范文(四)
本人曾在校社團聯(lián)合會網(wǎng)絡信息部和檢驗學院學生會工作，并擔任班干部;在校期間，組織策劃了“廣東醫(yī)學院首屆電子賀卡設計大賽”和“廣東醫(yī)學院首屆電子競技大賽”;加入了檢驗學院科研小組，成功申請并參與了“高效液相色譜儀檢測兒童食品中的色素含量”。這些經(jīng)歷培養(yǎng)了我良好的領導、管理、協(xié)作、交際溝通和創(chuàng)新能力，使我能客觀理智地面對問題，顧全大局，對凡事持尋求解決的態(tài)度。
一年的實習工作更是豐富了我的閱歷，培養(yǎng)了我開拓創(chuàng)新的思維和解決問題的能力，更加系統(tǒng)地掌握了臨床各項檢測的基礎理論和基礎操作技術，掌握了微生物、病毒的實驗檢驗原理和操作技術，熟悉專業(yè)儀器(如：pcr儀、酶標儀、icp儀，氣質聯(lián)用色譜儀，高效液相色譜儀，熒光光譜儀等)的性能和運用，有較強的綜合分析能力和動手能力，也具有一定的科研能力。
我性格開朗、積極上進;具有良好的團隊精神和人際關系，對待工作認真負責、勤懇耐勞，耐心細心，在工作中善于到激勵他人的作用，同時善于并熱愛與人溝通交流;敢于開拓創(chuàng)新，有著強烈的事業(yè)心與責任感，對人生和事業(yè)充滿熱情和憧憬。
醫(yī)學檢驗畢業(yè)生個人簡歷自我鑒定范文(五)
我于xx年9月經(jīng)過普通高考考入南方醫(yī)科大學(原第一軍醫(yī)大學)，本人性格開朗、穩(wěn)重、有活力，待人熱情、真誠。工作認真負責，積極主動，能吃苦耐勞。有較強的組織能力、實際
動手能力和團體協(xié)作精神，能迅速的適應各種環(huán)境，并融合其中。認真的學習態(tài)度和對本專業(yè)的濃厚的興趣，讓我在各方面都表現(xiàn)出色。
從大一開始，我就特別注重在認真學習好理論課的同時，努力培養(yǎng)自身的綜合素質，為學好專業(yè)課打下了良好的基矗從理論轉為專業(yè), 我熱愛我的專業(yè)并為之投入了巨大的熱情和精力，充分利用課余時間，拓寬知識視野，完善知識結構。通過閱讀大量的課外相關書籍來充實自己的專業(yè)知識。在競爭日益激烈的今天，我堅信只有多層次，全方位, 高要求的發(fā)展，并熟練掌握專業(yè)知識的人才，才符合社會發(fā)展的需要, 才符合用人單位的需求，才符合自身發(fā)展的要求。
在校期間，我還積極參加學院. 大學生運動會等多項大型活動，培養(yǎng)了我的交際能力，使我懂得了如何與人和睦相處。多年的軍校生活造就了我不怕苦不怕累的態(tài)度, 使我處事更務實、更有責任感。實習期間我嚴格遵守醫(yī)院的各項制度, 積累了豐富的工作經(jīng)驗，和完善的專業(yè)技能. 這一切都是我不懈努力的結果，也是我所具有積極進取精神的體現(xiàn)。相信這將是我今后的工作的重要經(jīng)驗和寶貴財富。
深厚的專業(yè)知識，完整的知識結構，豐富的實踐經(jīng)驗，樂觀豁達的性格，嚴謹?shù)能娦Ｉ? 超強的團體協(xié)作精神和親和力，定會助我在曲折中順利完成各項工作任務。
愿貴醫(yī)院給我一次嘗試施展自己潛能的機會，我會盡心盡責，盡我所能，讓貴醫(yī)院滿意，讓患者滿意!
篇三：菌落PCR鑒定
�。┚銹CR鑒定轉化子
1. PCR mix的制備
Taq buffer（10×） 20 μL
(轉 載于:wWw.cnboThwiN.cOM 博 威范文 網(wǎng):pcr室自我鑒定)
dNTP（2.5 mmol/L）5 μL
Primer Forward（50 mmol/L） 10 μL
Primer Reverse（50 mmol/L） 10 μL
ddH2O 147 μL
Taq（2U/μL） 8 μL
total 200 μL
將上述溶液混勻，10 μL每管分裝于200 μL PCR管中。
2. 常溫下隨機挑選轉化板上的轉化子，用滅菌的牙簽或槍頭挑取少量菌體，在LB瓊脂糖平板上輕點，做一拷貝；然后將沾有菌體的牙簽或槍頭置于相應的裝有PCR混合物的PCR管中洗滌數(shù)下（管子做好記號，將平板上點的克隆標號與管子上的對應起來，以便篩選到克隆后進行擴繁培養(yǎng)），蓋緊管子。
3. 將混有菌體的PCR混合物置于PCR儀中，按常規(guī)條件擴增。PCR反應程序根據(jù)具體的引物設置，參考下列程序：
95℃，3 min
95℃，30 s 56℃，30 s 72℃，50 s 30個循環(huán)
72℃，10 min。
4. 電泳檢測是否得到目的片斷。如有則為陽性克隆。（取5 μL PCR反應液與1 μL上樣緩沖液混合，進行1% 瓊脂糖電泳，5V/cm，選擇適當大小的DNA分子量標準，檢查擴增產(chǎn)物。紫外觀察PCR產(chǎn)物是否與插入片段大小一致？）
5. 將已經(jīng)接種有菌落的平板置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，使菌落擴增；次日挑選陽性克隆做進一步篩選或培養(yǎng)。步驟2也可以不點板，直接接種搖菌，盡可能安排在早上做PCR，下午就可以提質粒，得到重組載體。
（七）菌液PCR鑒定轉化子
1. 取培養(yǎng)過夜的轉化菌液20 μL，沸水浴3～5 min。
2. 室溫12 000r/min 離心2min。取上清液作為PCR的摸板，按下列反應體系配制
ddH2O 13.5 μL
10×PCR Buffer（25mM Mg離子） 2 μL
dNTP（10mM each） 0.5 μL
Primer l（20μM） 0.5 μL
Primer 2（20μM） 0.5 μL
模板DNA2 μL
TaqDNA聚合酶（2.5U）1 μL
總體積20 μL
3. 加一滴液體石蠟，混勻，短暫離心。
4. 在PCR儀上進行PCR反應。參考下列程序：
95℃，3 min
95℃，30 s，56℃，30 s，72℃，50 s，30個循環(huán)
72℃，10 min。
5. 電泳檢測是否得到目的片斷。
1 最簡單的：用槍尖或者牙簽從平板或液體中沾少量菌（多了就會影響反應了，沾上點就夠了），直接加入到PCR體系中反應就行了，依靠變性溫度來破裂細菌釋放DNA，我一直這樣做大量篩選。
2 旁邊實驗室的方法：用槍尖或者牙簽沾少量菌，加入到?jīng)]有加酶的PCR反應體系中，沸水浴5min，冷卻后加入酶，開始反應，有些不容易加熱破裂的菌預先煮沸一下，可以釋放更多的DNA，有利于PCR反應。
3 用Chelex，旁邊的旁邊的實驗室做菌種鑒定的時候習慣用的方法：可以去除一部分雜質，降低PCR反應所受的干擾。
1) 5%-10%chelex 50μl(配法：5-10g chelex 加入100ml TE)+菌苔，在管壁適當研磨，震蕩混勻，短暫離心
2) 煮沸：細菌5min，放線菌10-15min
3) 冷卻至室溫，10000-12000rpm離心5-8min，取上清擴增
注：chelex方法適于細菌、放線菌，chelex提前在65攝氏度水浴中預熱，溶液有細小顆粒，吸取時槍尖最好先剪掉，否則不好吸。
這3個方法由簡到繁，效果當然是依次提高了。我理解，這樣的直接以細菌為模板進行PCR反應，特別是前兩種，適用于大量的篩選和驗證，由于加入了細菌本身的其他物質以及難免引入的培養(yǎng)基成分，可能會對PCR反應造成干擾，假陽性假陰性都是可能出現(xiàn)的，所以之后最好還要進一步驗證。chelex方法可以去除一定的雜質，干擾較小，但是畢竟也不如直接以DNA為模板效果好。樓主需要根據(jù)自己的實際需要來選擇合適的方法。
把PCR MIX加好，最好把細菌用TIP沾點就可以了。變性溫度也不變，時間可長點兒，容易。
我也這樣做過，96度變性時延長為10min左右，幾乎都能擴增出來。
但鑒于我做的是革蘭氏陰性菌，對于陽性球菌，還真不好說。
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