6種草本藥用植物種子超低溫保存技術(shù)研究論文
超低溫冷凍保存指將材料放置在低于-80 ℃的環(huán)境中保存，通常是用液氮（-196 ℃）作為貯藏源，大多數(shù)的植物種質(zhì)在液氮中新陳代謝活動基本停止，處于“生機停頓”狀態(tài)[1]，可以達到長期保存的目的。因此已被廣泛應(yīng)用于生物種質(zhì)的長期保存，應(yīng)用范圍也在不斷擴大[2]。目前超低溫冷凍保存已成功應(yīng)用于植物材料、動物干細胞、魚蝦精細胞、微生物等的保存。其中植物材料包括種子、懸浮細胞[3]、愈傷組織[4]、胚[5-6]、花粉[7]、莖尖分生組織[8]、芽等。國內(nèi)外針對藥用植物種子超低溫保存的研究不多，李海兵等[9]對懷山藥種質(zhì)、何明高等[10]對束花石斛種子、任淑娟等[11]對七葉樹種子、Hirano等[12]對白芨種子進行了超低溫保存，在藥用植物種質(zhì)超低溫保存方式、種子含水量、化凍方式對超低溫保存后種質(zhì)存活率的影響取得了成果。
草本植物是區(qū)別于木本植物的一類植物的總稱，包括重要的糧食如小麥、玉米等，且有很多草本植物是中藥材的重要來源，例如黃芪、夏枯草、人參等。本研究對具有藥用價值的杜若、過江藤、夏枯草、皺果莧、羅勒和山香等6種草本藥用植物種子進行超低溫保存研究，對這些藥用植物種子超低溫保存的可行性和技術(shù)方法進行了探討，為具有藥用價值的草本植物的保護性開發(fā)提供技術(shù)。
1 材料與方法
1.1 材料
供試材料來自海南和廣東的草本植物杜若、過江藤、夏枯草、皺果莧、羅勒和山香種子，由國家南藥基因資源庫提供（表1）。
1.2 方法
1.2.1 種子含水量測定 根據(jù)《國際種子檢驗規(guī)程》（ISTA編，1999）采用高溫烘干法測定種子含水量（ω0），烘干溫度（103±2）℃，烘干時間16 h。ω0=（鮮重-絕干重）/鮮重×100%。
1.2.2 種子干燥 采用硅膠干燥法。將種子放入盛有硅膠的干燥器中，根據(jù)自然含水量經(jīng)不同時間干燥分別獲得含水量為13.50%（自然含水量）、11.90%、9.68%、7.89%和5.71%的杜若種子，含水量為11.20%（自然含水量）、10.69%、9.69%、8.44%和8.10%的過江藤種子，含水量為10.63%（自然含水量）、9.88%、8.02%和6.99%的夏枯草種子，含水量為16.18%（自然含水量）、13.88%、12.75%、10.67%和8.56%的皺果莧種子，含水量為26.33%（自然含水量）、20.87%、18.18%、13.86%和7.78%的羅勒種子和含水量為12.82%（自然含水量）、9.09%、7.63%、5.45%和4.55%的山香種子。
1.2.3 種子發(fā)芽方法 參照《國際種子檢驗規(guī)程》的規(guī)定。各試驗4個重復(fù)，每重復(fù)40粒。計算出種子（種胚）的發(fā)芽率=種子發(fā)芽數(shù)/實驗種子數(shù)×100%。
1.2.4 超低溫保存方法 目前使用的液氮超低溫保存方法主要有：緩慢冷凍法、直接冷凍法、玻璃化冷凍法、包埋脫水冷凍法、包埋玻璃化冷凍法等。根據(jù)實際情況，本實驗選用緩慢冷凍法、直接冷凍法和玻璃化冷凍法對6種草本藥用植物種子進行液氮超低溫保存實驗。
緩慢冷凍法：將種子放入加有保護液（PVS2）（室溫）的凍存管中，置于4 ℃冰箱中0.5 h，取出立即放入-20 ℃冰柜中1 h，1 h后迅速投入液氮中保存。PVS2：30%甘油+15%乙二醇+15%二甲亞砜+0.4 mol/L蔗糖。
直接冷凍法：將種子放入凍存管中直接投入液氮中保存。
玻璃化冷凍法：將種子放于裝載液（LS）中室溫處理20 min后，轉(zhuǎn)入PVS2進行30 min的冰水浴處理。冰水浴處理后將種子轉(zhuǎn)移至裝有預(yù)冷新鮮PVS2的凍存管中，迅速投入液氮中保存。LS：含2 mol/L甘油和0.4 mol/L蔗糖的MS液體培養(yǎng)基。
解凍：取出液氮中凍存48 h的凍存管，室溫化凍5 min。
洗滌：將解凍后的種子在室溫下用洗滌液（US）洗滌2～3次，每次5～10 min，再用無菌水洗滌2～3次，每次5～10 min。US：含有1.2 mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)液。
恢復(fù)培養(yǎng)：洗滌后的種子在濾紙上吸干后，轉(zhuǎn)移至發(fā)芽盒， 25～30 ℃、70%RH條件下培養(yǎng)。
1.3 數(shù)據(jù)分析
數(shù)據(jù)采用SAS軟件和Excel（2016）軟件進行統(tǒng)計分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 超低溫保存對種子發(fā)芽率的影響
超低溫保存種子效果的判定一般采用測定發(fā)芽率的方法，以種子進入液氮一段時間取出后有一定的發(fā)芽率來判定保存方法的成功與否[22]。本實驗6種草本藥用植物種子經(jīng)液氮處理后都有一定的發(fā)芽率，具體結(jié)果見表2。從表2可以看出，液氮超低溫冷凍對草本藥用植物種子發(fā)芽率影響不同，與對照組相比，其種子平均發(fā)芽率有降低的，也有提高的。經(jīng)3種不同冷凍方式處理冷凍后，杜若、夏枯草和皺果莧種子發(fā)芽率與對照相比，差異不顯著（p>0.05）；羅勒和山香種子其種子平均發(fā)芽率降低了15%～70%不等，其中降低幅度最大的是羅勒種子；過江藤種子平均發(fā)芽率由原來的61%提高至65.52%。
2.2 含水量對種子發(fā)芽率的影響
根據(jù)種子貯藏特性可將種子分為兩類，一類為耐脫水和低溫的正常性種子，另一類為不耐脫水和低溫的頑拗性種子[23]。由圖1可知，過江藤種子發(fā)芽率隨著含水量的下降而有所降低，從72.58%降至54.49%；而含水量的下降對杜若、夏枯草、皺果莧、山香和羅勒種子發(fā)芽率的影響不大，種子含水量低于10%時其發(fā)芽率均在70%以上。這表明過江藤種子不耐脫水干燥，杜若、夏枯草、皺果莧、山香和羅勒種子可脫水干燥。
超低溫冷凍過程中，種子的含水量是影響其生命力的一個關(guān)鍵因素。理論上講，含水量過高會使種子在冷凍和解凍過程中受到傷害甚至死亡，過低又會造成脫水傷害影響其活力[24]。本研究結(jié)果（圖1和表2），含水量5.71%～13.50%的杜若種子和8.56%～16.18%的皺果莧種子經(jīng)液氮超低溫冷凍后，其種子發(fā)芽率與對照相比，差異不顯著（p>0.05），且平均發(fā)芽率均在80%以上。液氮冷凍后的過江藤種子，除含水量9.69%外，其他含水量下的種子發(fā)芽率隨含水量的下降而急劇降低，與對照組相比，差異極顯著（p<0.01）。夏枯草種子含水量在6.99%～8.02%時，液氮冷凍后的種子發(fā)芽率較對照組下降明顯，含水量為9.88%～10.63%時，與對照組相比，液氮冷凍后的種子發(fā)芽率有所增加，這表明夏枯草種子超低溫冷凍的最佳含水量為8.02%。含水量5.45%～12.82%的山香種子，液氮超低溫處理前后其發(fā)芽率均存在顯著差異（p<0.05），且含水量低于7.63%的山香種子對照組發(fā)芽率隨含水量的下降而降低，冷凍組發(fā)芽率高于其它含水量，由此表明7.63%為山香種子液氮超低溫冷凍的最佳含水量。 羅勒種子含水量在7.78%～26.33%范圍時，液氮冷凍后其種子發(fā)芽率較對照組均存在極顯著差異（p<0.01）；含水量26.33%的羅勒種子冷凍后其發(fā)芽率幾乎為0，隨著含水量的下降，其冷凍組發(fā)芽率顯著提高。
2.3 冷凍方式對超低溫保存的影響
超低溫冷凍方式是液氮冷凍過程中影響種子活力的重要因素。常用的超低溫冷凍法有玻璃化冷凍、直接冷凍、緩慢冷凍、包埋冷凍等[25]，直接冷凍法能節(jié)約實驗成本，縮短實驗時間，且沒有化學(xué)物質(zhì)的傷害，但不是所有的種質(zhì)都適用于這個方式[26]。玻璃化溶液處理是緩慢冷凍法和玻璃化冷凍法的關(guān)鍵，玻璃化溶液中含有冷凍保護劑，易形成玻璃化狀態(tài)，并且很容易進入植物組織中，一旦快速冷凍時，植物組織形成玻璃化狀態(tài)，進一步使組織脫水，可以減輕傷害，提高存活率[27]。本研究采用了玻璃化冷凍、緩慢冷凍和直接冷凍3種冷凍方式對6種不同含水量范圍的草本藥用植物種子進行液氮超低溫冷凍，由表2顯示結(jié)果如下。
含水量5.71%～13.50%的杜若種子，經(jīng)液氮超低溫冷凍后其種子發(fā)芽率較對照相比雖有差異，但變化幅度不大，平均發(fā)芽率都在80%以上，其中緩慢冷凍組和直接冷凍組的發(fā)芽率顯著高于玻璃化冷凍組。
含水量8.10%～11.20%的過江藤種子，液氮冷凍后，其緩慢冷凍組和直接冷凍組的種子發(fā)芽率隨含水量的降低而急劇下降，特別是含水量為8.44%時的直接冷凍組和含水量8.10%時的緩慢冷凍組，其發(fā)芽率均由55%降至27%左右，降低幅度最大；含水量由11.20%降至10.69%時，玻璃化冷凍組的種子發(fā)芽率由對照的66.67%降至57.14%，而含水量在8.10%～9.69%之間時，玻璃化冷凍組的種子發(fā)芽率均高于對照組。結(jié)果表明，過江藤種子液氮超低溫冷凍試驗中，玻璃化冷凍法優(yōu)于緩慢冷凍法和直接冷凍法。
夏枯草種子含水量在6.99%～8.02%時，液氮冷凍后的種子發(fā)芽率較對照組有所下降，含水量6.99%的玻璃化冷凍組由75.76%降至45.83%，降低幅度最大；含水量在9.88%～10.63%時，液氮冷凍后的種子發(fā)芽率較對照組增加了，其中含水量10.63%的緩慢冷凍組增加幅度最大。結(jié)果顯示，緩慢冷凍后的種子平均發(fā)芽率顯著高于玻璃化冷凍和直接冷凍。
含水量為8.56%～16.18%的皺果莧種子，液氮超低溫冷凍后其種子發(fā)芽率雖有增加或降低，但變化幅度不大，平均發(fā)芽率都在82%以上，其中緩慢冷凍組的種子平均發(fā)芽率顯著高于玻璃化冷凍組和直接冷凍組。
山香種子含水量在4.55%～12.82%時，冷凍組的種子發(fā)芽率較對照組相比均下降了15%左右，其中含水量為9.09%時，冷凍后的種子發(fā)芽率低至60%，下降幅度最大；且玻璃化冷凍的種子平均發(fā)芽率顯著高于緩慢冷凍組和直接冷凍組。
羅勒種子含水量在7.78%～26.33%范圍時，液氮冷凍后其種子發(fā)芽率均有不同程度的下降，其中玻璃化冷凍組和緩慢冷凍組的種子發(fā)芽率甚至降為0；結(jié)果表明，直接冷凍法更適合于羅勒種子超低溫保存。
3 討論
有研究表明，液氮超低溫冷凍有促進種子萌發(fā)的作用，王荷等[22]在對25種野生花卉種子進行液氮超低溫保存實驗中發(fā)現(xiàn)，有12種野生花卉種子經(jīng)液氮冷凍后其發(fā)芽率顯著提高了。在本研究中，也有觀察到，含水量13.50%的杜若種子緩慢冷凍和直接冷凍后的發(fā)芽率高于對照組；含水量11.20%的過江藤種子和含水量16.18%、12.75%的皺果莧種子經(jīng)玻璃化冷凍和緩慢冷凍后，其種子發(fā)芽率高于對照組；含水量在9.88%～10.63%的夏枯草種子經(jīng)液氮冷凍后，種子發(fā)芽率高于對照組；含水量在13.86%～18.18%的羅勒種子經(jīng)直接冷凍后，其種子發(fā)芽率高于對照。有可能是液氮冷凍打破了種子的'休眠，也有可能是保護劑中的化學(xué)物質(zhì)的刺激[28]，具體機理還有待進一步研究。
種子只有在適宜的含水量范圍內(nèi)才能有效進行超低溫保存，降香黃檀種子超低溫冷凍的最適含水量范圍為10.54%～12.35%[24]，高良姜種子超低溫冷凍的最適含水量范圍為12.78%～13.58%[26]，白木香種子超低溫冷凍的最適含水量為7.35%[29]。本研究所試的6種草本藥用植物中，除羅勒外，其余5種草本藥用植物均實現(xiàn)了自然含水量下的超低溫保存，表明這5種草本藥用植物種子自然含水量在液氮超低溫保存的安全含水量范圍內(nèi)；而將自然含水量下的羅勒種子經(jīng)不同時間干燥后，獲得7.78%～20.87%含水量范圍內(nèi)的羅勒種子也成功實現(xiàn)了超低溫保存。表明多數(shù)草本藥用植物種子自然含水量在超低溫冷凍保存的安全含水量范圍之內(nèi)，需進一步擴大種類加以驗證。
我們承建的針對中藥材種質(zhì)超低溫保存庫——國家南藥基因資源庫，已于2015年初投入使用，并保存有400多種藥用植物種子。本研究成功地對杜若種子、過江藤種子、夏枯草種子、皺果莧種子、山香種子和羅勒種子等6種草本藥用植物種子進行了液氮超低溫保存，這將為中藥材種子的超低溫保存提供借鑒，為超低溫庫的建設(shè)提供理論基礎(chǔ)，有利于解決藥用植物種子批量入庫長期有效保存的問題，對推動我國藥用植物種質(zhì)資源安全保護起到積極作用。
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