淺談丹參酮ⅡA對心肌細胞損傷的修復作用的分析論文
1 材料
1.1 動物出生1～3 d雄性Wistar大鼠，SPF級，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號SCXK粵-20060015。
1.2 藥品與試劑
胎牛血清購自杭州四季青生物工程研究所；胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基購于Gibico公司；丹參酮ⅡA購于中國藥品生物制品檢定所（批號110766-200417）；乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。
2 方法
2.1 分組原代乳鼠心肌細胞經(jīng)分離、純化后進行實驗分組，分為以下幾組：①正常組：培養(yǎng)的正常心肌細胞培養(yǎng)；②模型組：心肌細胞培養(yǎng)液中添加200 μmol/L H2O2作用2 h；③丹參酮ⅡA高劑量組：心肌細胞用丹參酮ⅡA 1×10-4mol/L培養(yǎng)24h后添加200 μmol/L H2O2繼續(xù)作用2 h。④丹參酮ⅡA中劑量組：心肌細胞用丹參酮ⅡA 5×10-5mol/L培養(yǎng)24 h后添加200 μmol/L H2O2繼續(xù)作用2 h。⑤丹參酮ⅡA低劑量組：心肌細胞用丹參酮ⅡA 1×10-5mol/L培養(yǎng)24 h后添加200 μmol/L H2O2繼續(xù)作用2 h。
2.2 新生大鼠心肌細胞培養(yǎng)參照Goldenberg等［4］方法略加改進。取出生1～3 d SD乳鼠，在75％酒精中浸泡8s后取出，固定四肢。用無菌眼科剪剪開胸部，無菌眼科彎鑷取出心臟。迅速將心臟放入裝有冷D-Hanks液的培養(yǎng)皿中，去除心房及心外膜的結(jié)締組織，將心室剪開，洗凈殘血，反復洗3次。將心室肌在無菌培養(yǎng)皿側(cè)壁剪碎成1～2 mm3的小組織塊。將小組織塊移入50 ml塑料離心管中，加入0.1％胰蛋白酶5ml，37℃消化6 min。自然沉淀后去除第1次上清，再加入5 ml胰蛋白酶于37℃消化6 min后，輕輕吹打，自然沉淀后，取上清移入15 ml離心管中，加含血清培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心10 min，洗兩次。剩余沉淀繼續(xù)加胰蛋白酶消化，如此反復消化7～10次直至組織塊完全消化。將離心所得沉淀用含15％胎牛血清的培養(yǎng)基制成細胞懸液，在CO2培養(yǎng)箱中差速貼壁1 h，去除非心肌細胞（主要是成纖維細胞和內(nèi)皮細胞）。1 h后輕輕吸出細胞懸液，調(diào)整細胞密度，將心肌細胞懸液均勻接種于6孔板內(nèi)，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。前48 h加入終濃度為0.1 mmol/L的5-溴脫氧尿苷，每24 h換液1次。
2.3 心肌細胞活力檢測 采用MTT比色法測定心肌細胞活力。心肌細胞懸液以1.5×104/ml接種于96孔板。分組處理后，每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml），在培養(yǎng)箱中37℃孵育4 h。吸去上清，每孔加入DMSO 150 μl。微孔振蕩器上振蕩10 min。酶標儀檢測570 nm波長的吸光度值。每孔OD值減去空白孔OD值為測試孔OD值�；罴毎麛�(shù)與OD值成正比。每組每個時間點設6個復孔，取其平均值。
2.4 心肌細胞凋亡吸出培養(yǎng)液，D-Hanks洗細胞3次，5 min/次。向培養(yǎng)瓶中加入2～3 ml 0.125％胰蛋白酶（使用前應預熱至37℃左右），鏡下觀察細胞，待其變圓，細胞間分離但尚未脫落時倒去胰酶，加入原培養(yǎng)液終止消化，吹打瓶壁，使細胞脫落。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，1 000 r/min 離心5 min，加PBS重懸細胞，調(diào)整細胞濃度為1×106/ml，取0.5 ml上述細胞懸液，1 000 r/min 4 min離心，棄上清，加0.5 ml Binding Buffer重懸細胞，加入1μl熒光標記的Aannexin V試劑，混勻后避光室溫下孵育20 min。加入5μl PI混勻后避光4℃下孵育5 min，孵育后加入500 μl Binding Buffer，立即上流式細胞儀分析，激發(fā)波長Ex=488 nm; 發(fā)射波長Em=530 nm。
2.5 總抗氧化能力及氧化平衡體系酶測定
采用比色法測定總抗氧化能力（T-AOC），采用2,4-二硝基苯肼顯色法檢測LDH活性，硫代巴比妥酸法測定MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力，二硫代二硝基苯甲酸法測定GSH-Px含量，鉬酸銨法測定CAT活力。具體操作步驟參照試劑盒說明書。
2.6 統(tǒng)計分析
計量數(shù)據(jù)以均±s表示，采用 SPSS13. 0統(tǒng)計軟件進行分析。多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析 （One Way ANOVA）處理，組間兩兩比較采用LSD法。檢驗顯著性水準α＝0.05。
3 結(jié)果
3.1 丹參酮ⅡA對過氧化氫所致心肌細胞損傷的細胞活力與細胞凋亡的影響與正常組比較，模型組心肌細胞活力顯著降低，細胞凋亡率則顯著增加；在改善細胞活力方面，丹參酮ⅡA高劑量組細胞活力較模型組顯著增高，而丹參酮ⅡA中劑量、低劑量 與模型組比較無統(tǒng)計學差異。在改善細胞凋亡率方面，丹參酮ⅡA各劑量組細胞凋亡率均顯著低于模型組，中劑量與低劑量差異無統(tǒng)計學意義。丹參酮ⅡA對過氧化氫所致心肌細胞損傷抗氧化能力的影響與正常對照組比較，模型組心肌細胞總抗氧化能力、SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性顯著降低，而LDH活性、MDA含量則顯著增加；丹參酮ⅡA可呈劑量依賴性增加總抗氧化能力、SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性，降低LDH活性、MDA含量。
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