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天然產(chǎn)物化學(xué)課件
1. 分子印跡技術(shù)和固相萃取的原理
1.1 分子印跡技術(shù)
分子印跡技術(shù)(MIT)是近十幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一門邊緣科學(xué)技術(shù),是指制備對(duì)某一特定目標(biāo)分子具有特異選擇性的聚合物-分子印跡聚合物(MIPs)的過(guò)程,它結(jié)合了高分子化學(xué)、生物化學(xué)等學(xué)科,作為一種新型高效的分離技術(shù),具有空間專一識(shí)別性。
1.2 固相萃取
固相萃取(SPE)是利用固體吸附劑對(duì)液體試樣中各組分吸附力差異而實(shí)現(xiàn)分離的。固相吸附劑對(duì)目標(biāo)組分的選擇性越高,則分離效率越高。混合液通過(guò)吸附柱時(shí),目標(biāo)成分被吸附劑吸附,然后再利用洗脫液洗脫或加熱解析,達(dá)到富集目標(biāo)化合物的目的。根據(jù)目標(biāo)化合物的種類、性質(zhì)等選擇合適的固相萃取劑和洗脫液及其它優(yōu)化條件后,可以一步完成萃取、富集、凈化等操作,并可以與高效液相色譜、氣相色譜等聯(lián)用。固相萃取克服了一般液液萃取及一般層析柱的缺點(diǎn)。萃取過(guò)程簡(jiǎn)單快速、節(jié)省溶劑、重現(xiàn)性好、回收率高、減少了有機(jī)溶劑對(duì)操作人員和環(huán)境的影響。
2. 分子印跡固相萃取高效液相色譜
2.1 SPE-HPLC 聯(lián)用技術(shù)
MIPs 用作 SPE 的填料用來(lái)分離富集復(fù)雜樣品中的分析物，具有以下優(yōu)點(diǎn)：
（1）化學(xué)和物理穩(wěn)定性。MIPs 機(jī)械強(qiáng)度高，耐高溫、耐高壓，能抵抗酸、堿、高濃度離子、有機(jī)溶劑的作用，在復(fù)雜化學(xué)環(huán)境中能保持自身穩(wěn)定性
�。�2）能夠反復(fù)使用。已由文獻(xiàn)證明 MIPs 反復(fù)使用 300 次之后印跡能力也未發(fā)生衰減
�。�3）穩(wěn)定性好。有報(bào)道稱保存 8 個(gè)月之后其性能也不會(huì)發(fā)生改變Sellergren 等首先報(bào)道了 MIP - SPE（MISPE），應(yīng)用合成的戊烷分子印跡聚合物填充小柱，成功分離了尿中的潘他米丁，不用色譜分析便直接在解吸附后檢測(cè)出了結(jié)果。其后，更多關(guān)于 MISPE 的研究在不同領(lǐng)域得到了發(fā)展。具體固相萃取可以分為離線固相萃取和在線固相萃取兩種方法。
2.2 在線固相萃取
為了克服離線 MISPE 的缺點(diǎn)，發(fā)展出了在線MISPE 方法。這種方法實(shí)現(xiàn)了 MISPE 與分析系統(tǒng)的自動(dòng)化操作，由此避免了預(yù)富集和分析步驟間的樣品操作，因此減弱了分析物的損失，被污染的危險(xiǎn)，增加了靈敏度和重現(xiàn)性。同時(shí)，由于
MISPE 過(guò)程實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化，可以大大減少處理樣品的時(shí)間。另外，整個(gè)樣品提取在分析柱中進(jìn)行，所以樣品的用量可以更少。一般采用普通的六通閥與 HPLC 聯(lián)用，填料裝于不銹鋼小柱中，以適應(yīng) HPLC 系統(tǒng)的高壓
2.3 離線模式
目前,MISPE采用最多的還是離線模式,這種模式操作簡(jiǎn)單,可選用的溶劑和添加劑較多,并且不用考慮它們對(duì)分析的影響,因此,有更高的富集率和選擇性。其不足在于檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),會(huì)相應(yīng)增大誤差。離線模式一般分為4個(gè)步驟:平衡、上樣、清洗和洗脫。
2.4.1 固相萃取中分子印跡聚合物的制備
分子印跡聚合物的制備通常包括以下幾個(gè)步驟:功能單體與模板分子的功能基團(tuán)在適當(dāng)?shù)臈l件下可逆結(jié)合,形成復(fù)合物;加入交聯(lián)劑,使其與功能單體聚合,形成的聚合物將模板分子包埋在內(nèi);用物理和化學(xué)方法,將模板分子從聚合物中洗脫,以獲得具有識(shí)別功能并與之相匹配的三維空穴.
2.4.2模板分子與功能單體的相互作用
模板分子與功能單體之間的相互作用也可稱之為印跡,主要有共價(jià)印跡、非共價(jià)印跡和半共價(jià)印跡3種方式。非共價(jià)印跡過(guò)程中,模板分子和功能單體通過(guò)氫鍵、靜電相互作用、范德華力、疏水作用等非共價(jià)鍵作用結(jié)合形成復(fù)合物。此種方式形成速率快,也容易從復(fù)合物中去除模板分子,有較廣泛的模板分子選擇范圍,故有較大應(yīng)用潛力。但是,此種方式印跡制備的分子印跡聚合物(MIPs)結(jié)合位點(diǎn)不均一,容易引起模板分子滲漏現(xiàn)象。共價(jià)印跡在固相萃取中很少應(yīng)用。第三種是半共價(jià)印跡,這種方式是分子印跡聚合物用共價(jià)鍵印跡制備,而分子印跡聚合物與待測(cè)物質(zhì)之間僅僅依靠非共價(jià)鍵作用來(lái)結(jié)合,這樣,即能發(fā)揮它們的特長(zhǎng),又克服了彼此的不足
3 . 分子印跡固相萃取的應(yīng)用
3.1 環(huán)境試樣分析中的應(yīng)用
環(huán)境試樣的分析是環(huán)境保護(hù)中的一個(gè)重要環(huán)節(jié),起著重要的作用。MISPE作為一種新的高效分離方法,在環(huán)境樣品的分析中已得到廣泛應(yīng)用。Antonio等制備了24種分子印跡聚合物,用于土壤中BPA的固相萃取研究。Zhang Jiang-hua等用沉淀聚合法制備分子印跡聚合物,并在優(yōu)化的條件下探討了人血清、豬尿、自來(lái)水和蝦等4種試樣中雙酚A(BPA)的固相萃取。Nuria等用高效液相色譜法在線反相固相萃取系統(tǒng)研究了含有11種痕量酚類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)水樣,選擇性地富集和萃取了4-硝基苯酚。己烯雌酚是一種雌激素物質(zhì),存在量極少,難于富集及分析。
3.2 食品分析中的應(yīng)用
食品中有害物質(zhì)或微生物的含量一般都很低,當(dāng)其含量低于方法的檢出限而又高于允許含量標(biāo)準(zhǔn)時(shí),就必須對(duì)其進(jìn)行提取和富集操作后,才能進(jìn)行定量檢測(cè),
并制定相應(yīng)的食品安全標(biāo)準(zhǔn)。MISPE能有效地對(duì)樣品進(jìn)行提取和富集,提高了檢測(cè)設(shè)備靈敏度,有利于建立更嚴(yán)格、更完善的食品安全標(biāo)準(zhǔn)。Robert等探討了不同模板對(duì)分子印跡聚合物識(shí)別性的影響,用MISPE分析了葡萄酒樣品中櫟精以及相關(guān)的黃酮類物質(zhì),為葡萄酒的預(yù)處理提供了一種快捷方便的方法。念珠鐮刀菌素是一種低相對(duì)分子質(zhì)量的毒枝菌素,需要一些能在分子水平上識(shí)別念珠鐮刀菌素的物質(zhì)。
3.3 生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用
生物醫(yī)藥試樣的檢測(cè)大多是針對(duì)痕量物質(zhì)的富集和分離,且要求檢測(cè)過(guò)程精確、快速、高效,MI-SPE適應(yīng)了這一要求。在人的血漿、血清及各組織中有害物質(zhì)的檢測(cè)和分析方面,MISPE取得了不少進(jìn)展。Zoe等與Andersson等分別以布比卡因和布比卡因的結(jié)構(gòu)類似物為模板合成分子印跡聚合物,分析了人類血漿中的羅哌卡因和布比卡因。Tang等研究了MISPE對(duì)人類血漿和血清中頭孢硫脒的富集、分離,回收率達(dá)到了98%。曹璽珉等制備了環(huán)丙沙星分子印跡聚合物,研究結(jié)果表明:該印跡聚合物具有良好的分子識(shí)別性能
4. 未來(lái)展望：
SPE-HPLC 具有選擇性好、穩(wěn)定、可以重復(fù)使用且造價(jià)比較低等特點(diǎn),因此,廣泛應(yīng)用于環(huán)境、生物醫(yī)藥、食品等試樣中分析物的富集或去除。但是,此種技術(shù)還有很多方面需要改進(jìn)。例如,分子印跡聚合物合成過(guò)程中印跡和聚合的方式,模板分子滲漏現(xiàn)象,固相萃取復(fù)雜樣品中生物大分子目前還非常少等。另外,MISPE將會(huì)與更多的儀器聯(lián)用,發(fā)展成為一種更好的在線快速檢測(cè)方法�？傊�,隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善,MISPE將會(huì)成為一種高效、簡(jiǎn)便、快捷的分析工具。
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