分子熒光光譜法實(shí)驗(yàn)報(bào)告范文
一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
1.掌握熒光光度計(jì)的基本原理及使用。
2.了解熒光分光光度計(jì)的構(gòu)造和各組成部分的作用。
3.掌握分子熒光光度計(jì)分析物質(zhì)的特征熒光光譜：激發(fā)光譜、發(fā)射光譜的測定方法。
4.了解影響熒光產(chǎn)生的幾個(gè)主要因素。
5.學(xué)會(huì)運(yùn)用分子熒光光譜法對物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。
二、 實(shí)驗(yàn)原理
原子外層電子吸收光子后，由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，再回到較低能級或者基態(tài)時(shí)，發(fā)射出一定波長的輻射，稱為原子熒光。對于分子的能級激發(fā)態(tài)稱為分子熒光，平時(shí)所說的熒光指分子熒光。
具有不飽和基團(tuán)的基態(tài)分子經(jīng)光照射后，價(jià)電子躍遷產(chǎn)生熒光，是當(dāng)電子從第一激發(fā)單重態(tài)S1的最低振動(dòng)能級回到基態(tài)S0各振動(dòng)能級所產(chǎn)生的光輻射。
(1)激發(fā)光譜
是指發(fā)光的`某一譜線或譜帶的強(qiáng)度隨激發(fā)光波長(或頻率)變化的曲線。橫坐標(biāo)為激發(fā)光波長，縱坐標(biāo)為發(fā)光相對強(qiáng)度。
激發(fā)光譜反映不同波長的光激發(fā)材料產(chǎn)生發(fā)光的效果。即表示發(fā)光的某一譜線或譜帶可以被什么波長的光激發(fā)、激發(fā)的本領(lǐng)是高還是低；也表示用不同波長的光激發(fā)材料時(shí)，使材料發(fā)出某一波長光的效率。熒光為光致發(fā)光，合適的激發(fā)光波長需根據(jù)激發(fā)光譜確定——激發(fā)光譜是在固定熒光波長下，測量熒光體的熒光強(qiáng)度隨激發(fā)波長變化的光譜。獲得方法：先把第二單色器的波長固定，使測定的λem不變，改變第一單色器波長，讓不同波長的光照在熒光物質(zhì)上，測定它的熒光強(qiáng)度，以I為縱坐標(biāo)，λex為橫坐標(biāo)所得圖譜即熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜，從曲線上找出λex，，實(shí)際上選波長較長的高波長峰。
(2)發(fā)射光譜
是指發(fā)光的能量按波長或頻率的分布。通常實(shí)驗(yàn)測量的是發(fā)光的相對能量。發(fā)射光譜中，橫坐標(biāo)為波長（或頻率），縱坐標(biāo)為發(fā)光相對強(qiáng)度。
發(fā)射光譜常分為帶譜和線譜，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)既有帶譜、又有線譜的情況。 發(fā)射光譜的獲得方法：先把第一單色器的波長固定，使激發(fā)的λex不變，改變第二單色器波長，讓不同波長的光掃描，測定它的發(fā)光強(qiáng)度，以I為縱坐標(biāo)，λem為橫坐標(biāo)得圖譜即熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜;從曲線上找出最大的λem。
(3)熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系
用強(qiáng)度為I0的入射光，照射到液池內(nèi)的熒光物質(zhì)時(shí)，產(chǎn)生熒光，熒光強(qiáng)度If用儀器測得，在熒光濃度很稀(A<0.05)時(shí)，熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光強(qiáng)度If與濃度有下面的關(guān)系：If=KC。
三、 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器
試劑：羅丹明B乙醇溶液；1-萘酚乙醇溶液；3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide：標(biāo)準(zhǔn)溶液，10μg/ml, 20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml和未知濃度；蒸餾水；乙
醇。
儀器：Fluoromax-4熒光分光光度計(jì)；1cm比色皿；spectrofluorometer分析軟件。
熒光分析儀器結(jié)構(gòu)：它主要由光源、單色器、液槽、檢測器和顯示器組成。光源發(fā)出的紫外-可見或者紅外光經(jīng)過激發(fā)單色器分光后，照到熒光池中的被檢測樣品上，樣品收到該激發(fā)光照射后，發(fā)出的熒光經(jīng)發(fā)射單色器分光，由光電倍增管轉(zhuǎn)換成相應(yīng)電信號，再經(jīng)放大器放大反饋進(jìn)入轉(zhuǎn)換單元，將模擬電信號轉(zhuǎn)換成相應(yīng)數(shù)字信號，并通過顯示器或打印機(jī)顯示和記錄被測樣品譜圖。
四、 實(shí)驗(yàn)步驟
1.樣品制備。配置不同濃度的3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide溶液，分別為10μg/ml, 20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml和未知濃度。
2.打開熒光分光光度計(jì)和電腦，預(yù)熱半個(gè)小時(shí)。
3.打開spectrofluorometer分析軟件，進(jìn)行相關(guān)參數(shù)的設(shè)置。首先檢測羅丹明B的激發(fā)光譜，此時(shí)固定發(fā)射波長為560nm，檢測并保存激發(fā)光譜。然后根據(jù)所檢測的激發(fā)光譜中的最大峰值541nm來設(shè)置檢測羅丹明B的熒光光譜的激發(fā)波長，檢測并保存所得的熒光光譜。
4.檢測1-萘酚的熒光光譜。方法同步驟3。
5.用已配置好的3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行與2中相同的步驟，找到最大激發(fā)波長與最大發(fā)射波長，之后選定單點(diǎn)檢測模式，并設(shè)置成剛選擇的最大激發(fā)波長與最大發(fā)射波長，分別對10μg/ml, 20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml進(jìn)行檢測，記錄數(shù)據(jù)，繪制工作曲線。
6.對未知濃度3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide進(jìn)行檢測，記錄數(shù)據(jù)，并根據(jù)工作曲線求出濃度。
五、 數(shù)據(jù)記錄和處理
1． 數(shù)據(jù)記錄
(1)羅丹明B的測定
圖2.羅丹明B的激發(fā)光譜
圖3.羅丹明B的熒光光譜
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