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紙層析的實驗報告
篇一：紙層析法分離氨基酸實驗報告
前言
紙層析法 紙層析法又稱紙色譜法，是目前廣泛應(yīng)用的一種分離技術(shù)。本世紀(jì)初俄國植物學(xué)家M.Tswett發(fā)現(xiàn)并使用這一技術(shù)證明了植物的葉子中不僅有葉綠素還含有其它色素�，F(xiàn)在層析法已成為生物化學(xué)、分子生物學(xué)及其它學(xué)科領(lǐng)域有效的分離分析工具之一。它是一種以紙為載體的色譜法。固定相一般為紙纖維上吸附的水分，流動相為不與水相溶的有機溶劑；也可使紙吸留其他物質(zhì)作為固定相，如緩沖液，甲酰胺等。將試樣點在紙條的一端，然后在密閉的槽中用適宜溶劑進(jìn)行展開。當(dāng)組分移動一定距離后，各組分移動距離不同，最后形成互相分離的斑點。將紙取出，待溶劑揮發(fā)后，用顯色劑或其他適宜方法確定斑點位置。根據(jù)組分移動距離（Rf值）與已知樣比較，進(jìn)行定性。用斑點掃描儀或?qū)⒔M分點取下，以溶劑溶出組分，用適宜方法定量（如光度法、比色法等）。
紙層析法（paper chromatography）是生物化學(xué)上分離、鑒定氨基酸混合物的常用技術(shù)，可用于蛋白質(zhì)的氨基酸成分的定性鑒定和定量測定；也是定性或定量測定多肽、核酸堿基、糖、有機酸、維生素、抗菌素等物質(zhì)的一種分離分析工具。紙層析法是用濾
紙作為惰性支持物的分配層析法，其中濾紙纖維素上吸附的水是固定相，展層用的有機溶溶劑是流動相。
在環(huán)境分析測試中，有時用紙層析法分離試樣組分，它用于一些精度不高的分析，如3，4-苯并芘。但不如GC、HPLC應(yīng)用普遍。在
做葉綠體色素分離時用到,將葉片碾碎，浸出綠色液體，將液體與層析液（石油醚）混合，將濾紙一段進(jìn)入混合液體，四種色素在層析液中的溶解度不同，在濾紙上留下4條色素帶。由此觀查出各種色素的相對含量和種類。
紙層析法一般用于葉綠體中色素的分離，葉綠體中色素主要包括胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素a、葉綠素b，它們在層析液中的溶解度不同，溶解度大的隨層析液在濾紙上擴(kuò)散地快，反之則慢；含量較多者色素帶也較寬。最后在濾紙上留下4條色素帶，所以利用紙層析法 能清楚地將葉綠體中的色素分離。
氨基酸 氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，廣泛用于食品、醫(yī)藥、添加劑及化妝品行業(yè)。隨著生物工程技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展逐漸成為2l世紀(jì)全球的主要產(chǎn)業(yè)之一，氨基酸的需求量越來越大，品種變更越來越快，工藝改革越來越新。目前全世界氨基酸每年的.產(chǎn)量為100萬噸，而需求總量是800萬噸。我國自20世紀(jì)60年代起，氨基酸的應(yīng)用在食品工業(yè)占61％，在飲料工業(yè)占30％，醫(yī)藥、日用化工、農(nóng)業(yè)、冶金、環(huán)保、輕工、生物工程技術(shù)等方面占用的比例逐年增加。
氨基酸在人類生活的很多方面都有著應(yīng)用：
(1)在食品行業(yè)的應(yīng)用
(2)在醫(yī)藥工業(yè)的應(yīng)用
(3)在飼料添加劑行業(yè)的應(yīng)用
(4)在化妝品行業(yè)的應(yīng)用
(5)在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用
(6)在其他行業(yè)的應(yīng)用
氨基酸工業(yè)還有著廣闊的發(fā)展前景：
(1)傳統(tǒng)的氨基酸生產(chǎn)方法
(2)運用基因工程手段生產(chǎn)氨基酸
(3)大力發(fā)展藥用中間體,具體為：
�、侔被峒捌溲苌镏饾u成為藥用中間體
②非天然氨基酸是合成活性藥物的重要原料
�、凵a(chǎn)高附加值的非天然氨基酸
一、實驗?zāi)康?/strong>
(1)掌握分配層析的原理，學(xué)習(xí)氨基酸紙層析法的操作技術(shù)（包括點樣、平衡、展層、顯色）。
(2)學(xué)習(xí)未知樣品的氨基酸成分（水解、層析及鑒定）分析的方法。
二、實驗原理
(1)紙層析是以濾紙為惰性支持物的分配層析。濾紙纖維上的羥基具有親水性，吸附一層水作為固定相，有機溶劑為流動相。當(dāng)有機相流過固定相時，物質(zhì)在兩相間不斷分配而得到分離。
(2)溶質(zhì)在濾紙上的移動速度用比移值Rf值表示。
(3)Rf=原點到層析斑點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離。
(4)在一定的條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。本實驗利用紙層析法分離氨基酸。材料與方法
三、實驗裝置與試劑
(1)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)液(1mg/ml)
亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)液。
(2)80%甲醇
(3)0.1%茚三酮丙酮溶液
(4)氨基酸混合液(每種氨基酸500mg/mL)
(5)正丁醇
實驗儀器
(1)新華濾紙×1
(2)培養(yǎng)皿×1
(3)電熱鼓風(fēng)干燥箱×1
(4)吹風(fēng)機×1
(5)毛細(xì)管×4
（6）針、線、尺×1
�。�7）鐘罩(高約430mm,直徑約290mm，具磨口塞)×1
實驗操作
(1)濾紙
選用國產(chǎn)新華 1號濾紙， 6cm×7cm。在距濾紙2cm處劃線，用
鉛筆在線上標(biāo)上四個點作為點樣位子（留出縫線空間）。
（2）點樣
點樣要合適，樣品點的太濃，斑點易擴(kuò)散或拉長，以致分離不清。用毛細(xì)管吸取氨基酸樣品，與濾紙垂直方向輕輕碰觸點樣處的中心，這時樣品就自動流出。點樣的擴(kuò)散直徑控制在0.5cm之內(nèi)，點樣過程中必須在第一滴樣品干后再點第二滴，為使樣品加速干燥，可用吹風(fēng)機吹干，但要注意溫度不可過高，以免氨基酸破壞，影響定量結(jié)果。 將點好樣品的濾紙兩側(cè)比齊，用線縫好，揉成筒狀。注意縫線處紙的兩邊不要接觸。避免由于毛細(xì)管現(xiàn)象使溶劑沿兩邊移動特別快而造成溶劑前沿不齊，影響Rf值。
(3)展層
將揉成圓筒狀的濾紙放入培養(yǎng)皿內(nèi) (注意濾紙不要碰皿壁)，當(dāng)溶劑展層至距離紙的上沿約1cm時，取出濾紙，立即用鉛筆標(biāo)出溶劑前沿位置。
酸溶劑系統(tǒng)：
正丁醇： 80%甲酸：水=15:3:2(體積比)，茚三酮2ml。溫度25℃，時間1h。
注意：使用的溶劑系統(tǒng)需新鮮配制，并要搖勻。
�。�4）顯色
待展層基本結(jié)束后, 置65℃鼓風(fēng)箱中10-20min，鼓風(fēng)保溫，濾紙上即顯出紫紅色/黃色斑點。
�。�5）Rf值的計算
篇二：氨基酸的薄層層析實驗報告
實驗六 紙層析法觀察轉(zhuǎn)氨基作用
【實驗名稱】：紙層析法觀察轉(zhuǎn)氨基作用
09救援一班 第三大組 李嵐宇 2009222336
室溫：28°
（一）實驗?zāi)康模?/strong>
1、學(xué)習(xí)氨基酸紙層析的基本原理。
2、掌握氨基酸紙層析的操作原理。
（二）實驗原理：
轉(zhuǎn)氨基作用是氨基酸代謝過程中的一個重要反應(yīng)，在轉(zhuǎn)氨酶的催化下，氨基酸的а-酮酸與α-酮基的互換反應(yīng)稱為轉(zhuǎn)氨基作用。轉(zhuǎn)氨基作用廣泛地存在于機體各組織器官中，是體內(nèi)氨基酸代謝的重要途徑。氨基酸反應(yīng)時均由專一的轉(zhuǎn)氨酶催化，此酶催化氨基酸的α－氨基轉(zhuǎn)移到另一α－酮基酸上。各種轉(zhuǎn)氨酶的活性不同，其中肝臟的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）催化如下反應(yīng)：
α—酮戊二酸 + 丙氨酸谷氨酸 + 丙酮酸
本實驗以丙氨酸和α-酮戊二酸為底物，加肝勻漿保溫后，用紙層析法檢查谷氨酸的出現(xiàn)，以證明轉(zhuǎn)氨基作用。紙層析屬于分配層析。以濾紙為支持物，濾紙纖維與水親合力強，水被吸附在濾紙的纖維素的纖維之間形成固定相。有機溶劑與水不相溶，把預(yù)分離物質(zhì)加到濾紙的一端，使流動溶劑經(jīng)此向另一端移動，這樣物質(zhì)隨著流動相的移動進(jìn)行連續(xù)、動態(tài)的`不斷分配。由于物質(zhì)分配系數(shù)的差異，而使移動速度就不一樣，在固定相中，分配趨勢較大的組分，隨流動相移動的速度就慢，反之，在流動相分配趨勢較大的成分，移動速度快，最終不同的組分彼此分離，物質(zhì)在紙上移動的速率可以用比值Rf表示： ALT
物質(zhì)在一定的溶液中的分配系數(shù)是一定的，故比值Rf也相對穩(wěn)定，因此在同一層析體系中可用Rf值來鑒定被分離的物質(zhì)。
（三）實驗材料與儀器：
試劑：
1、0.01mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液。
2、0.2mol/L Na2HPO4溶液81ml與0.2mol/L NaH2PO4溶液19ml混勻,用蒸餾水稀釋20倍。
3、0.1mol/L丙氨酸溶液稱取丙氨酸0.891克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液中,以1.0 N NaOH仔 細(xì)調(diào)至pH7.4后, 加磷酸鹽緩沖液至100ml。
4 、0.1mol/Lα－酮戊二酸稱取α－酮戊二酸1.461克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液中，以1.0 N NaOH仔細(xì)調(diào)至pH 7.4 后，加磷酸鹽緩沖液至100ml。
5、0.1mol/L 谷氨酸溶液稱取谷氨酸0.735克,先溶于少量0.01mol/LpH 7.4磷酸鹽緩沖液中，以1.0 N NaOH仔細(xì)調(diào)至pH 7.4 后, 加磷酸鹽緩沖液至50 ml。
6、0.5%茚三酮溶液稱取茚三酮0.5克于100 ml丙酮中溶解。
7、層析溶劑：將重蒸過的酚2份和水1份按比例混合后，放入分液漏斗中，震蕩，靜置24小時后分層，將下部酚層轉(zhuǎn)移到瓶中備用。
儀器：玻璃勻漿器、10ml試管、培養(yǎng)皿、表面皿、沸水浴鍋、37℃恒溫水浴箱、9cm圓濾紙、烘箱、手術(shù)剪刀、分液漏斗。
（四）實驗步驟:
1、肝勻漿制備：取新鮮動物肝0.5克,剪碎后放入勻漿器,加入冷0.01mol/LpH 7.4磷酸鹽緩沖液1.0 ml,迅速研成勻漿， 用上述緩沖液4.5ml混勻備用。
2、 酶促反應(yīng)過程
（1）取離心管兩支，編號：1（測定管）、2（對照管），各加肝勻漿0. 5ml。把對照管放沸水浴中加熱10分鐘，取出冷卻。
�。�2）各加0.1mol/L丙氨酸0.5 ml, 0.1mol/Lα-酮戊二酸0.5 ml,0.01mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液1.5 ml,搖勻。
�。�3）37℃保溫，30分鐘后取出，保溫完畢。
�。�4）把測定管放沸水浴中煮10分鐘，取出后冷卻，過濾。
3、層析
�。�1）取圓形濾紙一張（直徑9cm）放潔白紙上，以圓點為中心，約1 cm為半徑,用鉛筆劃一圓線作為基線,在線上四等份處標(biāo)清四點編號作為點樣原點。
�。�2）點樣：用四根毛細(xì)玻璃管分別進(jìn)行點樣。把丙氨酸液、谷氨酸液分別點在原點2、4處。把測定液、對照液分別點在原點1、3處。注意斑點不宜過大（應(yīng)在直徑0.5cm以下）。在第一次點樣點干后，再在原處同樣點第2次。
�。�3）層析：先在濾紙圓心處打一小孔（鉛筆芯粗細(xì)），再取濾紙一條卷成捻如燈芯狀,上端插入濾紙中心孔中，下端剪成須狀。
（4）把濾紙平放在上述培養(yǎng)皿上，使紙芯下浸入層析液中，蓋上培養(yǎng)皿蓋�？梢妼游鲆貉丶埿旧仙綖V紙中心，漸向四周擴(kuò)散。當(dāng)層析液前緣到離濾紙邊緣約1cm時，約25分鐘，取出濾紙，用鑷子小心取下紙芯，放入烘箱中烘干。
�。�5）顯色：將上述濾紙平放在培養(yǎng)皿上，滴0.5％茚三酮的丙酮溶液，使濾紙全部濕潤，再放入烘箱干燥，此時可見紫色斑出現(xiàn)，比較色斑的位置，及色澤深淺，計算Rf值，分析是否發(fā)生了轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)。
（五）實驗結(jié)果記錄：
（六）實驗討論：
1、從表格（1）中可以看出，測定管上清液點樣出現(xiàn)了兩個色斑，根據(jù)Rf值的計算也可以看出，測定管中氨基酸發(fā)生了轉(zhuǎn)氨基作用，生成的未知物質(zhì)b為谷氨酸，則未知溶質(zhì)a為丙氨酸；對照管中因為酶的失活而沒有發(fā)生轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，只有丙氨酸，所以色斑只有一個。
2、層析點樣時手要洗凈，操作中盡可能少量接觸濾紙，以免污染。
3、層析液中含有腐蝕性酚，取用時注意安全，防止濺到皮膚及眼睛。
4、點樣點不宜過大，直徑小于0.5cm.
2010年9月19日
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